Kryoprezervácia buniek je jednou z hlavných výziev súčasnej kryobiológie. Jej cieľom je zabezpečiť reprodukovateľnosť buniek pri ich zmrazovaní a rozmrazovaní. Spôsob, akým bude kryoprezervácia prevedená môže výrazne ovplyvniť kvalitu buniek. Je preto potrebné zaviesť také protokoly, ktoré zabezpečia dobrý fyziologický stav buniek po rozmrazení. Úspešná kryoprezervácia si vyžaduje starostlivé zváženie niekoľkých kľúčových faktorov vrátane spôsobu zmrazovania a rozmrazovania a taktiež výberu vhodného kryoprotektívneho činidla v správnej koncentrácii. Cieľom tejto štúdie je optimalizácia protokolu kryoprezervácie ľudských keratinocytov preskúmaním nižších koncentrácií kryoprotektívneho činidla dimetylsulfoxid (DMSO) v zmrazovacom médiu ako je koncentrácia štandardne používaná. Bunky zmrazujeme s rôznymi koncentráciami DMSO (1.8%; 2.2%; 5% a 10% v/v) a krátkodobo (počas troch dní) ich uchovávame pri teplote ̶ 80 °C. Po rozmrazení ich porovnávame s čerstvými nezmrazenými bunkami. Zameriavame sa pritom na viabilitu buniek po rozmrazení, proliferáciu a metabolickú aktivitu po procese kryoprezervácie a sledujeme zmeny v biofyzikálnych charakteristikách, ktoré vznikajú v membránach buniek. Sledujeme zmeny vonkajšej morfológie buniek po rozmrazení a analyzujeme ich ultraštruktúru. Z dostupnej literatúry a našich predbežných výsledkov sa ukazuje, že ľudské keratinocyty je možné zmraziť s koncentráciou DMSO do 2.2 % a krátkodobo ich skladovať pri nízkych teplotách, čo sa preukazuje pomerne vysokou viabilitou po rozmrazení a schopnosťou buniek ďalej rásť v kultivačnom médiu. Taktiež pozorujeme schopnosť rozmrazených buniek vytvoriť súvislú monovrstvu, keď ich necháme priľnúť na podložku. Znamená to, že DMSO v koncentráciách do 2.2 % v zmrazovacom médiu môže ochrániť keratinocyty počas ich krátkodobej kryoprezervácie. Tieto zistenia majú prínos v optimalizácii vybraných metodík získavania, kryouchovávania a hodnotenia kvality buniek pre ich ďalšie využitie v biomedicínskych aplikáciách v ďalších experimentoch.
Táto práca je podporená projektami: APVV-SK-BY-RD-19-0019, KEGA- 041UK-4/2020, APV-SK-PL-21-0073, VEGA 2/0108/22.
Akkök, Ç. A., Liseth, K., Hervig, T., Ryningen, A., Bruserud, Ø., & Ersvær, E. (2009). Use of different ME2SO concentrations for cryopreservation of autologous peripheral blood stem cell grafts does not have any major impact on levels of leukocyte-and platelet-derived soluble mediators. Cytotherapy, 11(6). https://doi.org/10.3109/14653240902980443
Best, B. P. (2015). Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research, 18(5). https://doi.org/10.1089/rej.2014.1656
Borderie, V. M., Lopez, M., Lombet, A., Carvajal-Gonzalez, S., Cywiner, C., & Laroche, L. (1998). Cryopreservation and culture of human corneal keratocytes. Investigative Ophthalmology and Visual Science, 39(8).
Colombo, I., Sangiovanni, E., Maggio, R., Mattozzi, C., Zava, S., Corbett, Y., Fumagalli, M., Carlino, C., Corsetto, P. A., Scaccabarozzi, D., Calvieri, S., Gismondi, A., Taramelli, D., & Dell’Agli, M. (2017). HaCaT Cells as a Reliable in Vitro Differentiation Model to Dissect the Inflammatory/Repair Response of Human Keratinocytes. Mediators of Inflammation, 2017. https://doi.org/10.1155/2017/7435621
Fujita, T., Takami, Y., Ezoe, K., Saito, T., Sato, K., Takeda, N., Yamamoto, Y., Homma, K., Jimbow, K., & Sato, N. (2000). Successful preservation of human skin by vitrification. Journal of Burn Care and Rehabilitation, 21(4). https://doi.org/10.1097/00004630-200021040-00004
Galvao J., Davis B., Tilley M., Normando E., Duchen M.R., Cordeiro M.F. (2014). Unexpected Low-Dose Toxicity of the Universal Solvent ME2SO. FASEB J. 28(3). doi: 10.1096/fj.13-235440.
Gásková, D.; Brodská, B.; Herman, P.; Večer, J.; Malínský, J.; Sigler, K.; Benada, O.; Plásek, J. (2007). Fluorescent probing of membrane potential in walled cells: diS-C3(3) Assay in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 14 . https:// doi: 10.1002/(sici)1097-0061(19980930)14:13<1189::aid-yea320>3.3.co;2-b.
Gironi B, Kahveci Z, McGill B, Lechner B-D, Pagliara S, Metz J, et al. (2020). Efect of ME2SO on the mechanical and structural properties of model and biological membranes. Biophys J.119:274–86. doi: 10.1016/j.bpj.2020.05.037.
Hughes, Z. E., Mark, A. E., & Mancera, R. L. (2012). Molecular dynamics simulations of the interactions of ME2SO with DPPC and DOPC phospholipid membranes. Journal of Physical Chemistry B, 116(39). https://doi.org/10.1021/jp3035538
Chen, X., & Thibeault, S. (2013). Effect of ME2SO concentration, cell density and needle gauge on the viability of cryopreserved cells in three dimensional hyaluronan hydrogel. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. https://doi.org/10.1109/EMBC.2013.6610976
Chan, Y., Gao, J., Bai L., Marshall Ch. (2014). Dimethyl Sulfoxide damages mitochondrial integrity and membrane potencial in cultured astrocytes. PLOS ONE, 9(9): e107447. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107447
Jang, T. H. (2017). Cryopreservation and its clinical applications | Elsevier Enhanced Reader. Integrative Medicine Research. 6(1). doi: 10.1016/j.imr.2016.12.001.
Jesus AR, Duarte ARC, Paiva A. (2022) Use of natural deep eutectic systems as novel cryoprotectants in mammalian cell vitrification. Sci Rep. 12 (1): 8095. doi: 10.1038/s41598-022-12365-4.
Kaiser, D., Otto, N. M., McCallion, O., Hoffmann, H., Zarrinrad, G., Stein, M., Beier, C., Matz, I., Herschel, M., Hester, J., Moll, G., Issa, F., Reinke, P., & Roemhild, A. (2021). Freezing Medium Containing 5% ME2SO Enhances the Cell Viability and Recovery Rate After Cryopreservation of Regulatory T Cell Products ex vivo and in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.750286
Klbik, I., Čechová, K., Milovská, S., Švajdlenková, H., Maťko I., Lakota, J., Šauša, O. (2023). Polyethylene glycol 400 enables plunge - freezing cryopreservation of human keratinocytes. Journal of Molecular Liquids, 379(121711).https://doi.org/10.1016/j.molliq.2023.121711
Klbik I., Čechová K., Milovská S., Rusnák J. (2022). Cryoprotective Mechanism of ME2SO Induced by the Inhibitory Effect on Eutectic NaCl Crystallization. J. Phys. Chem. Lett. 13, 48. https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.2c03003
Lakota J., Fuchsberger P. (1996). Autologous stem cell transplantation with stem cells preserved in the presence of 4,5 and 2,2% ME2SO. Bone Marrow Transplant. 18(1).
Leonard, R.J., Garcia, M.L., Slaughter, R.S., Reuben, J.P. (1992). Selective blockers of voltage-gated K + channels depolarize human T lymphocytes: a mechanism for the antiproliferative effect of charybdotoxin. Proc. Nat. Akad. Sci. USA (89). https://doi.org/10.1073/pnas.89.21.10094
Mazur P. (1984). Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol. 247(3 Pt 1):C125-42. https://doi.org/10.1152/ajpcell.1984.247.3.C125.
Mizuno M. (2022). Cell membrane fluidity and ROS resistance define ME2SO toelrance of cryopreserved synovial MSCs and HUVECs. Stem Cell Research and Therapy, 16.
Naaldijk, Y., Johnson, A. A., Friedrich-Stöckigt, A., & Stolzing, A. (2016). Cryopreservation of dermal fibroblasts and keratinocytes in hydroxyethyl starch-based cryoprotectants. BMC Biotechnology, 16(1). https://doi.org/10.1186/s12896-016-0315-4
Polák Š.: Atlas of the Ultrastructure of Human Organs in the Scanning Electron Microscopeb(2022. LF UK Bratislava, ISBN: 978-80-223-5347-2.
Pasch, J., Schiefer, A., Heschel, I., & Rau, G. (1999). Cryopreservation of keratinocytes in a monolayer. Cryobiology, 39(2). https://doi.org/10.1006/cryo.1999.2197
Saraste, A., & Pulkki, K. (2000). Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. In Cardiovascular Research (Vol. 45, Issue 3). https://doi.org/10.1016/S0008-6363(99)00384-3
Simonetti, O., Ferretti, G., Offidani, A. M., Gervasi, P., Curatola, G., & Bossi, G. (1996). Plasma membrane fluidity of keratinocytes of normal and psoriatic skin: A study using fluorescence anisotropy of trimethylammoniumdiphenylhexatriene (TMA-DPH). Archives of Dermatological Research, 288(1). https://doi.org/10.1007/BF02505043
Šikurová, L., Nemcová P., Kvasnička P. Hianik T.: Fluorescence anisotrophy studies of ACTH interaction with lecithin bylayers. (1997). Journal of Fluorescence. 7 (1).
Teasdale, B., Sieber, V. K., Riches, D. J., & Nanchahal, J. (1993). Cryopreservation of cultured dermal fibroblast impregnated collagen gels. Burns, 19(5). https://doi.org/10.1016/0305-4179(93)90062-D
M. Verheijen, M. Lienhard, Y. Schrooders, O. Clayton, R. Nudischer, S. Boerno, B. Timmermann, N. Selevsek, R. Schlapbach, H. Gmuender, S. Gotta, J. Geraedts, R. Herwig, J. Kleinjans, F. Caiment, Me2SO induces drastic changes in human cellular processes and epigenetic landscape in vitro, Sci Rep. 9 (2019) 1-12. https://doi.org/10.1038/s41598-019-40660-0.
L. Weng, P.R. Beauchesne, Dimethyl sulfoxide-free cryopreservation for cell therapy: A review, Cryobiology. 94 (2020) 9-17. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2020.03.012.