INTERAKTÍVNA KONFERENCIA
MLADÝCH VEDCOV

Charakterizácia proteínových derivátov s lytickou doménou SLT pôvodom z proteínu gp15 korynefága BFK20

Kristína Pápayová 1 Lucia Bocánová 1 Mária Kajsiková 1 Gabriela Bukovská 1

1Ústav molekulárnej biológie, Slovenská akadémia vied
kristina.papayova@savba.sk

Bakteriálny kmeň Brevibacterium flavum CCM251 je priemyselný kmeň využívaný pre biotechnologickú produkciu L-lyzínu. Zároveň je jediný hostiteľský kmeň lytického bakteriofága BFK20. Fágová kontaminácia BFK20 vo fermentačnej kultúre vedie k vysokým stratám vo výrobnom procese, preto sa tento fág podrobne analyzoval. Sekvenčná analýza genómu bakteriofága BFK20 odhalila (okrem iných) prítomnosť štrukturálneho génu orf15 kódujúceho chvostíkový proteín gp15. Na proteíne boli identifikované proteínové domény: TMP (tape measure protein), ktorá bola popísaná ako hlavný faktor determinujúci dĺžku fágového chvostíka a SLT (soluble lytic transglycosylase) doména, charakteristická prevažne pre bakteriálne procesy spojené s remodeláciou peptidoglykánu bunkovej steny. U bakteriofágov je prítomnosť SLT domény spájaná so zvýšenou účinnosťou infekcie hostiteľskej bunky. Štúdiom lytickej aktivity proteínov s SLT doménou získame poznatky o degradačných vlastnostiach proteínov kódovaných bakteriofágmi a zároveň objasníme mechanizmus fágovej infekcie bakteriálneho hostiteľa. Proteomickou analýzou pomocou 2D elektroforézy bola pozorovaná prítomnosť proteolytického štiepenia proteínu gp15 na dva proteíny: gp15a (1 298 aa) s predpokladanou lytickou aktivitou a gp15b (306 aa).

Cieľom našej práce bolo exprimovať oblasť SLT domény s variabilnou dĺžkou priľahlých sekvencii a navzájom porovnať vlastnosti vzniknutých proteínov. Celkovo bolo navrhnutých 6 rôznych SLT konštruktov (SLT01 - SLT06), ktoré vznikli úpravou sekvencie. Ako expresný vektor sme používali pET28a+, do ktorého sme naklonovali úseky DNA orf15 zodpovedajúce sekvenciám pre SLT01, SLT05 a SLT06. Takto pripravenými konštruktami sme transformovali kompetentné bunky E. coli BL21(DE3). Na expresiu sme využívali TB médium s obsahom kanamycínu, ktoré sme naočkovali nočnou kultúrou buniek BL21(DE3) nesúcimi konštrukty pET_SLT01, pET_SLT05 a pET_SLT06.

Rekombinantné proteíny SLT01, SLT05 a SLT06 sme nadprodukovali z konštruktov a izolovali afinitnou chromatografiou IMAC. Pomocou western blot analýzy sme zistili, že dochádza k štiepeniu izolovaných proteínov. Predpokladáme, že k štiepeniu dochádza v závislosti od terciárnej štruktúry aminokyselinových oblastí priľahlých k doméne SLT. Pomocou bioinformatického prístupu sme vytvorili modely predikujúce 3D-štruktúru študovaných proteínov. Zároveň sme pozorovali výrazné zníženie produkcie rekombinantného proteínu SLT06. Exprimovaný proteín s lytickou aktivitou je pre bunky E. coli pravdepodobne toxický alebo dochádza k výraznej inhibícii delenia buniek exprimujúcich proteín SLT06.

Predložená práca bola financovaná z projektov VEGA 2/0139/18 Štúdium replikačných proteínov modelových bakteriofágov v systéme bakteriofág – hostiteľ a APVV-16-0168 Príprava bakteriofágov na terapiu vaginálnych a močových infekcií.