Mikroglie predstavujú hlavné imunokompetentné bunky CNS. Sú prvou odpoveďou na infekciu alebo poškodenie tkaniva v CNS a iniciujú zápalovú odpoveď. So stúpajúcim vekom podliehajú zmenám nielen ich funkcie ale aj fenotyp
1,2 . Po opakovaných aktiváciách sa mikroglie nedokážu vrátiť na svoju bazálnu úroveň a stávajú sa hypersenzitizovanými. Na druhej strane, v starnúcom mozgu sa môžu vyskytovať v senescentnej forme (typická je replikačná senescencia, dystrofia, veľké množstvo vakuol)3. Najväčším zmenám podliehajú mitochondrie (stúpajúca produkcia RFK, dysfunkcie respiračného reťazca) a lyzozómy, kde sa akumuluje lipofuscín - nedegradovateľný polymérny fluorescenčný materiál4. Oba fenotypy - hypersenzitívny aj senescentný sa môžu vyskytovať za rozličných podmienok počas starnutia a oba zvyšujú riziko vzniku neurodegeneratívnych ochorení.Vytvorenie podpornej gliovej vrstvy predstavuje primárny krok v izolačných postupoch zameraných na získanie gliových sub-populácií ako sú mikroglie ale aj oligodendrocyty. Kritickými faktormi môže byť účinnosť disociácie tkaniva, vitalita získanej bunkovej suspenzie, eliminácia myelínovej debris, ale aj vek zvieraťa. Cieľom našej štúdie bolo charakterizovať podpornú gliovú vrstvu založenú z cerebrálneho tkaniva rôzne starých potkanov kmeňa Wistar (2 a 22 mesačné jedince) v skorých štádiách jej stabilizácie.
Rozdiely v zložení podpornej gliovej vrstvy v oboch typoch kultúr sme hodnotili z hľadiska ich morfológie na štvrtý deň in vitro (4DIV). Väčšie zastúpenie buniek s kontrastnými vakuolami a typickou ramifikáciou poukazovalo na prítomnosť fagocytujúcich mikroglií. V kultúrach založených z mladých jedincov bolo evidentné zastúpenie aj iných typov buniek.
Po ďalších 2 DIV sme z podpornej vrstvy založili sekundárnu kultúru, ktorú sme charakterizovali pomocou imunocytochémie. Zaujímavosťou bolo zistenie, že v prípade 22 mesačných jedincov sme získali pomerne homogénnu populáciu buniek so zvýšenou autofluorescenciou a fagocytárnou morfológiou. Kultúra bola pozitívna na izolektín B4, špecifický marker pre mikroglie a vo zvýšenej miere akumulovala neutrálnu červenú (typická vlastnosť fagocytov). V mladých kultúrach bolo evidentné väčšie zastúpenie buniek polygonálnej morfológie len nepatrne akumulujúcich toto farbivo. Predpokladáme, že by mohlo ísť o fibroblasty alebo endotelové bunky, pretože neboli pozitívne ani na jeden zo sledovaných markerov (CD45 - marker exprimovaný makrofágmi, GFAP - marker pre astrocyty, Gal - galaktocerebrozid, marker pre oligodendrocyty). Spektrofluorimetrickou analýzou sme v starých bunkách kvantitatívne dokázali vyšší signál autofluorescencie a tiež zníženie mitochondriálneho membránového potenciálu, čo potvrdzuje zníženie proteolytickej kapacity a mitochondriálnych funkcií spojené so starnutím.
Z výsledkov vyplýva, že gliovú podpornú vrstvu pripravenú zo starých potkanov nemožno, vzhľadom k chýbajúcim komponentom poskytujúcim trofickú podporu a funkčným zmenám v dôsledku starnutia, použiť k dlhodobým kultiváciám s následnou izoláciou sub-populácií. Vzhľadom k jej homogénnosti však môže predstavovať vhodný model pre krátkodobé štúdie starnutia mikroglií a možnosti jeho farmakologického ovplyvnenia.
Práca bola finančne podporená grantom VEGA 2/0031/12.
1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D. & Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front. Cell. Neurosci. 7, 45 (2013).
2. Norden, D. M. & Godbout, J. P. Review: microglia of the aged brain: primed to be activated and resistant to regulation. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 39, 19–34 (2013).
3. Olah, M., Biber, K., Vinet, J. & Boddeke, H. W. G. M. Microglia phenotype diversity. CNS Neurol. Disord. Drug Targets 10, 108–118 (2011).
4. Wong, W. T. Microglial aging in the healthy CNS: phenotypes, drivers, and rejuvenation. Front. Cell. Neurosci. 7, 22 (2013).
otazka
nevsimla som si, ze ma to vyplo zo systemu..a dalo ako guest. tak, len aby ste vedeli,ze ta otazka je odo mna :)
Re: otazka
dobry den, velmi pekne dakujem za zaujem aj otazku.
Ano, robili sme aj kvantitativnu analyzu, no v prezentacii uvadzam len reprezentativne obrazky. Momentalne pracujeme na porovnavani vysledkov z jednotlivych kultur. Kedze experimenty este prebiehaju, neuviedla som vsetky analyzy.
Ale porovnavali sme napriklad reaktivitu starsej kultury po farmakologickom ovplyvneni testovanymi latkami pouzitím markera izolektin B4. No tieto vysledky uz boli prezentovane (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584914013045).
membranovy potencial
Pekny den prajem,
velmi pekna studia, mozem sa opytat ako ste merali membranovy potencial mitochondrii. Kedysi sme pouzivali sondu JC-1, na srdcove mitochondrie .. aku sondu ste prosim pouzili? A este jedna otazocka .. neuvazovali ste o tom, ze znizeny membranovy potencial u starsich potkanov, moze znamenat vacsiu stabilitu potencialu a tym aj snahu o udrzanie funkcie mitochondrii? este raz gratulujem k skvelym vysledkom a vopred dakujem za odpovede.
Re: membranovy potencial
Dobrý deň,
veľmi pekne ďakujem za otázku. Áno, aj my sme v práci na sledovanie membránového potencialu použili sondu JC-1.
Čo sa tyka druhej otázky, tam je to trochu komplikovanejšie. Existujú viaceré teórie starnutie, teória starnutia podla mitochondriálno-lyzozomálnej osi (Brunk and Terman, 2002) tvrdi, že zo všetkých bunkových organel mitochondrie a lyzozómy podliehajú najväčším zmenám v procese starnutia. Mitochondrie sa štruktúrne dezorganizujú, zväčšujú sa a produkujú stále väčšie množstvá ROS, s poklesom ich funkcie súvisí aj znižovanie membránového potencialu. Či je to adaptačný proces je otázne, možno vo veľmi malej miere ak vôbec. Osobne by som sa skôr priklonila k tej druhej možnosti- sprievodnému javu starnutia ako takého - poškodenia, senescenia, starnutie a s tým suvisejúci pokles funkcii.
Re: Re: membranovy potencial
Dakujem pekne za odpoved.. Budeme radi ak pridete 11teho na vyhodnotenie, mozme sa porozpravat o vasej zaujimavej problematike a pripadne sa dohodnut aj o moznej spolupraci.. Drzim palce.