High-molar-mass hyaluronan (HA) under pathological conditions often degrades yielding low-molar-mass HA fragments. Reactive oxygen species may initiate degradation of high-molar-mass HA leading to a loss of its physiological function. The present study was designed to test the effect of the antirheumatic drug N-(2-mercapto-2-methylpropionyl)-l-cysteine against free-radical-mediated HA degradation initiated by 100-µM ascorbate plus 1-µM Cu(II). Time-dependent decrease of HA dynamic viscosity reflecting HA degradation was recorded by rotational viscometry. Oximetry was applied to follow the overall process. Free-radical scavenging activity of the compound tested was evaluated by the ABTS and DPPH assays. HA fragments were studied by non-isothermal chemiluminometry (CL), thermogravimetry (TGA), differential scanning calorimetry (DSC), Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) and size-exclusion chromatography with a multi-angle light scattering photometer (SEC-MALS). Rotational viscometry revealed that N-(2-mercapto-2-methylpropionyl)-l-cysteine completely inhibited the decrease of dynamic viscosity of HA solution, which might indicate N-(2-mercapto-2-methylpropionyl)-l-cysteine-mediated protection of HA from its oxidative degradation. Scavenging activity of N-(2-mercapto-2-methylpropionyl)-l-cysteine represented by IC50 4 and 9 μM for ABTS•+ and DPPH• respectively is really valuable. Oximetry showed that compound tested effectively reduced oxygen consumption after initiation of the oxidative HA degradation. On the contrary, the data of SEC-MALS indicated that the oxidative HA degradation took place also in the presence of compound tested. Furthermore, CL, TGA and DSC demonstrated that N-(2-mercapto-2-methylpropionyl)-l-cysteine did not significantly prevent the decrease of hydroperoxide content in the HA sample. Finally, FT-IR and ICP-MS showed that generated thiyl radicals did not incorporate into the HA biopolymer. Concluding, our data suggest that effects of N-(2-mercapto-2-methylpropionyl)-l-cysteine towards oxidative HA degradation observed in vitro could be partially involved in preventing/treating the oxidative degradation of HA in vivo.
Supported by the VEGA grants 2/0011/11, 2/0149/12, APVV 0351-10.
... zopar otazok
Ahoj, rad by som sa spytal na zopar veci k tvojej praci.
- Ako si vysvetlujes, ze derivat cysteinu, kery ste pridavali do systemu sice viedol k zastaveniu poklesu viskozity systemu, ale MALS ukazalo, ze hyaluronan degradoval aj tak?
- Vies, aky je osud toho derivatu cysteina po reakcii s reaktivnym radikalom? Dochadza k dimeracii, alebo niecomu inemu?
Dakujem a prajem vela uspechov do buducna
Re: ... zopar otazok
Ahoj, ďakujem za obé otázky.
- Ako si vysvetlujes, ze derivat cysteinu, ktory ste pridavali do systemu sice viedol k zastaveniu poklesu viskozity systemu, ale MALS ukazalo, ze hyaluronan degradoval aj tak?
Vzorky, ktoré obsahovali prídavok 100 μM N-(2-merkapto-2-metylpropionyl)-L-cysteínu, či už na začiatku degradácie hyalurónanu (HA), alebo 1 hodinu po iniciácií degradácie HA vykazovali pokles molekulovej hmotnosti HA. Molekulová hmotnosť komerčného hyalurónanu P0207-1 bola stanovená na 886,1 kDa. Tzv. „referenčná“ vzorka obsahujúca hyalurónan P0207-1, 1 µM Cu(II) a 100 µM askorbátu mala molekulovú hmotnosť 217,2 kDa (to že molekulová hmotnosť klesla bolo želané a logické). Vzorky obsahujúce hyalurónan P0207-1, 1 µM Cu(II) a 100 µM askorbátu a 100 μM bucilamínu v prídavku na začiatku degradácie, resp. 1 hodinu po iniciácií degradácie HA mali molekulové hmotnosti 370,9 a 418,2 kDa. Z uvedených skutočností vyplýva, že síce dynamická viskozita roztoku HA v rámci rotačnej viskozimetrie neklesala, čo naznačuje že molekulová hmotnosť neklesala, ale súčasne práve SEC-MALS nám potvrdilo, že molekulová hmotnosť testovaných roztokov HA s obsahom 100 μM N-(2-merkapto-2-metylpropionyl)- L-cysteínu výrazne klesla. Vysvetľujem si to pôsobením dvoch protichodných javov. Na jednej strane sa fragmentovaný HA čiastočne oxiduje a jeho molekulová hmotnosť sa znižuje. Na druhej strane, môže testovaná zlúčenina obsahujúca síru akoby zvýšiť molekulovú hmotnosť ťahaním fragmentov HA do zvitkov hyalurónanu spojením s oxidovanými štruktúrami a v dôsledku šmykového namáhania môže dôjsť k reopexií, t.j. paralelne sa zvýší viskozita. Tieto dva protichodné javy, a síce zníženie molekulovej hmotnosti v dôsledku degradácie a reopexia, v dôsledku spojenia asociátov z testovanej zlúčeniny obsahujúcej síru, vyvolaná šmykovým napätím v rotačnom viskozimetri, sa môžu medzi sebou vzájomne vyrovnávať/kompenzovať. (Niečo podobné platí aj u synoviálnej tekutiny, v literatúre - Oates, K. M. N.; Krause, W. E.; Jones, R. L.; Colby, R. H. J R Soc Interface 2006, 3, 167–174.)
- Vies, aky je osud toho derivatu cysteina po reakcii s reaktivnym radikalom? Dochadza k dimeracii, alebo niecomu inemu?
Predpokladám že by mohlo dochádzať ku generácií monotyil radikálu •S-R-SH. Ten by mohol rekombinovať s ďalším monotyil radikálom podľa reakcie: •S-R-SH + •S-R-SH → HS-R-S-S-R-SH. Disulfidický produkt HS-R-S-S-R-SH môže poskytnúť •H čím by došlo k vytvoreniu tyilového radikálu typu R-S-S-R-S•. Následne by dochádzalo k multimerizácií.
Ďakujem za milé prianie. Vsetko dobre aj Tebe!