2-(4-hydroxyfenyl)etyl β-D-glukopyranozid (salidrozid, CAS 10338-51-9) má širokú škálu biologických účinkov, ako napríklad účinky: antioxidačné, protirakovinové, antivirálne, protizápalové, antidiabetické, taktiež sa vyznačuje neuroprotektívnymi, kardioprotektívnymi a hepatoprotektívnymi vlastnosťami (1,2,3). Využíva sa často v tradičnej medicíne, kde sú jeho hlavným zdrojom rastliny z rodu Rhodiola, tento rod pozostáva z asi 90 druhov (vrátane 16-tich endemických druhov v Číne), pričom množstvo z nich bolo v Rusku, severnej Európe a Číne v minulosti využívaných ako adaptogény (4). Tyrozol galaktozid (2-(4-hydroxyfenyl)etyl β-D-galaktopyranozid) je analóg salidrozidu obsahujúci ako sacharidovú zložku β-D-galaktopyranózu. Tento analóg vykazuje vyššiu antioxidačnú účinnosť in vitro aj in vivo (5).
V tejto štúdii predstavujeme syntézu salidrozidu a jeho analógu (tyrozol galaktozid) pomocou transglykozylácie s použitím celobiózy, resp. laktózy ako donora glykozidu a tyrozolu ako akceptora. Na syntézu boli použité robustné zdroje enzýmov so špecifickou β-glukozidázovou (Novozym 188, Novozymes, Dánsko) a β-galaktozidázovou (Fungal lactase, Shin Nihon, Aichi, Japonsko) aktivitou.
Pri syntéze salidrozidu boli optimálne koncentrácie substrátov 0,22 M (tyrozol) a 0,45 M (celobióza). Maximálny výťažok 11,9 % bol dosiahnutý po dvoch hodinách inkubácie. Testovaný bol aj vplyv pH na aktivitu enzýmu v rozsahu 3-8 s použitím acetátového a fosfátového tlmivého roztoku. Maximálna konverzia bola pozorovaná pri pH 3 a 4, avšak výsledky boli podobné ako pri reakcii bez použitia tlmivého roztoku. Tieto výsledky zrejme súvisia so zmenou pH reakčnej zmesi vplyvom pH tekutej formy enzýmového prípravku. Pri syntéze tyrozol galaktozidu boli optimálne koncentrácie 0,29 M (tyrozol) a 1 M (laktóza). Maximálny výťažok 20,8 % bol dosiahnutý po jednej hodine inkubácie pri optimálnom pH 5,5 (testovaný rozsah 3-6, acetátový tlmivý roztok).
Produkty boli izolované chromatograficky na kolóne Sephadex LH-20 a salidrozid navyše purifikovaný flash chromatografiou na silikagéli elúciou gradientom metanolu v chloroforme. Čistota produktov bola overená na HPLC podľa metódy Mao a kol. (6) a štruktúra potvrdená pomocou NMR spektroskopie.
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy č. APVV-0846-12 a za finančnej podpory projektu VEGA č. 2/0138/12
(1) Li Zhang, Huixin Yu, Yang Sun, Xiufeng Lin, Bo Chen, Chen Tan, Guoxian Cao, Zhengwu Wang, Salidroside protects cardiomyocyte against hypoxia-induced death: A HIF-1α-activated and VEGF-mediated pathway. European Journal of Pharmacology 607, pg. 6-14 (2009), ISSN 0014-2999.
(2) Haibo Wang, Yuanyuan Ding, Jun Zhou, Xiaoli Sun, Siwang Wang, The in vitro and in vivo antiviral effects of salidroside from Rhodiola rosea L. against coxsackievirus B3. Phytomedicine 16, pg. 146-155 (2009), ISSN 0944-7113.
(3) Han-Bing Li, Ya-kun Ge, Xiao-Xiang Zheng, Le Zhang, Salidroside stimulated glucose uptake in skeletal muscle cells by activating AMP-activated protein kinase. European Journal of Pharmacology 588, pg. 165–169 (2008), ISSN 0014-2999.
(4) Kunjun Fu, Hideaki Ohba, Michael G. Gilbert, Rhodiola. Flora of China 8, pg. 251 (2009), ISBN 0-88192-238-2.
(5) Tian-yao Shi, Shu-fang Feng, Jiang-hao Xing, Yu-mei Wu, Xiao-qiang Li, Nan Zhang, Zhen Tian, Shui-bing Liu, Ming-gao Zhao, Neuroprotective effects of salidroside and its analogue tyrosol galactoside against focal cerebral ischemia in vivo and HO-induced neurotoxicity in vitro. Neurotoxicity Research 21 (4), pg. 358 (2012), ISSN 1029-8428.
(6) Yu Mao, Yan Li, Ning Yao, Simultaneous determination of salidroside and tyrosol in extracts of Rhodiola L. by microwave assisted extraction and high-performance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 45, pg. 510–515 (2007), ISSN 0731-7085.
... par otazok
Ahoj, rad by som sa spytal zopar otazok:
- Su zname nejake chemicke syntezy tych dvoch produktov, co si syntetizovala (i.e. bez pouzitia enzymov)?
- Pri tvojej transglykozidacii - ako si vysvetlujes, ze celobioza je reaktivnejsia, nez tvoj produkt?
- Ako svoj system pre optimalizaciu reakcii si si zvolila glykozid nitrofenola. Rozlisuje/nerozlisuje tvoj enzym(y) glykozidy fenolov/alifatickych alkoholov?
- V optimalizacnych studiach mas vytazky - voci comu su stanovovane (alkohol, alebo celobioza)? Tusis, ake boli konverzie tvojich latok v reakcii (tj. vies, kde skoncila vsetka hmota)?
- Chapem, ze si chcela pracovat vo vodnom prostredi (mas to ako jeden z cielov). Ale evidentne limitujucim faktorom tvojej syntezy je nizka rozpustnost alkoholu, potazmo jeho nizkej koncentracie. Uvazovala si nad pouzitim nejakeho relativne netoxickeho kosolventu, jako napriklad DMSO, alebo MeCN? Prezil by to tvoj enzymaticky system?
Dakujem a prajem vela uspechov v dalsej praci.
Re: ... par otazok
Ďakujem za otázky. Áno, sú známe chemické syntézy Salidrozidu a jeho analógov (vrátane Tyrozol galaktozidu), na čom pracujú aj kolegovia z nášho oddelenia. V prípade záujmu o kilogramovú produkciu je zaujímavá napríklad publikácia Shi a kol. (2011, Synthetic Communications vol. 41 (17), p. 2594-2600). Tento proces však môže zahŕňať aj určité nevýhody, ktoré by komplikovali prípadnú medicínsku aplikáciu produktov. Preto sme sa rozhodli v tejto práci využiť enzymatickú syntézu, ktorá je rýchla, stereoselektívna a relatívne nenáročná.
Čo sa týka druhej otázky, pri reakcii nie je tak dôležitý rozdiel v reaktivite ako skôr priebeh procesu v čase. Aby som to lepšie vysvetlila, na začiatku je prítomná celobióza, resp. laktóza v nadbytku (v podstate na začiatku produkt nie je prítomný). V procese transglykozylácie potom dochádza k niekoľkým dejom a to: k väzbe donora glykozidu (celobióza, resp laktóza) na enzým, ďalej k syntéze produktu a jeho hydrolýze, zároveň s primárnou hydrolýzou donora. Dôležitý je však pomer rýchlostných konštánt (rýchlosti syntézy produktu a rýchlosti jeho hydrolýzy). V momente, kedy sa tieto konštanty vyrovnajú dochádza k zmene kinetickej kontroly reakcie na termodynamickú kontrolu a začne prevažovať hydrolýza produktu, čiže vtedy je akoby reaktívnejší produkt.
Pri optimalizácii reakcií nebol použitý p-nitrofenyl glykozid (pNPG). Ten slúžil na kvantifikáciu aktivity enzýmu za definovaných podmienok, pretože množstvo uvoľneného pNP sa jednoducho meria (spektrofotometricky). Samozrejme, že pri syntéze s rôznym akceptorom glykozidu (fenolický/alifatický) je možné predpokladať rôzne hodnoty rýchlostných konštánt pre daný enzým, ale v tomto prípade bol testovaný iba tyrozol, ktorý je súčasťou oboch pripravených produktov.
Pri optimalizácii bola teoretická výťažnosť, resp. konverzia vypočítaná vzhľadom k tyrozolu, ktorého množstvo v reakčnej zmesi bolo tiež sledované (údaje v prezentácii uvedené nie sú), praktická výťažnosť produktov (po purifikácii) bola uvedená až v závere. Avšak čo sa týka množstva celobiózy (resp. laktózy) a produktov ich hydrolýzy, tie stanovované neboli.
Využitie netoxických kosolventov by mohlo byť predmetom ďalšej štúdie. Z literatúry vieme, že pri syntéze salidrozidu reverznou hydrolýzou boli testované rôzne rozpúšťadlá (t-butanol, dioxán, acetón, DMSO, a i.) aj iónové kvapaliny, vždy však bol potrebný určitý obsah vody pre správnu funkciu enzýmu. Avšak podľa môjho názoru dosiahnutie porovnateľného, resp. vyššieho výťažku za neporovnateľne kratší čas (1-2 h oproti 48 h a viac pri reverznej hydrolýze) je zaujímavým výsledkom. Ešte raz ďakujem za otázky a dúfam, že som na nich poskytla dostačujúce odpovede.
Re: Re: ... par otazok
... dakujem za objasnenie, jak to je s tym nitrofenolatom, ja som si z prezentacie myslel, ze bol pouzity aj pri optimalizacii (prave preto, ze sa lahko stanovuje) :)
Este jednu vec sa spytam - neviem, ze ci je s ohladom na jednoduchost spracovania zmesi/ceny prekurzorov lepsie pouzit nadbytok celobiozy, alebo alkoholu, ale kedze sa pracuje v kinetickom rezime - nebolo by mozno zaujimave pridavat pocas reakcie jednu z tychto zloziek (cim by sa urychlila reakcia v nasom - ziaducom smere)? Bolo by mozne nejako kontinualne separovat produkt zo zmesi? (tipoval by som, ze by v nejakom solvent systeme mohol vypadavat z reakcnej zmesi)
Pekna prace, vela zdaru do buducna prajem :)