Kmeňové bunky predstavujú nezrelé bunky s vysokým potenciálom špecializácie na rôzne typy buniek v celom tele. Hrajú kľúčovú úlohu pri vývoji tkanív a orgánov, ako aj pri udržiavaní homeostázy a integrity mnohobunkových organizmov [1].

Mezenchýmové kmeňové bunky (MKB) sú multipotentné nehemopoetické kmeňové  bunky stromálneho pôvodu. V roku 2006 boli Medzinárodnou spoločnosťou pre bunkovú terapiu (International Society for Cell Therapy) navrhnuté tri minimálne kritéria, ktoré definujú MKB: 1. Za štandardných kultivačných podmienok vytvárajú fibroblastové kolónie (colony forming units-fibroblast); 2. Napriek tomu, že nie sú charakterizované špecifickými povrchovými markermi, pre ich imunofenotyp je typická absencia hemopoetických antigénov; 3. Pod vplyvom definovaných in vitro alebo in vivo podmienok sa môžu diferencovať do buniek mezodermálneho pôvodu [2].

Napriek tomu, že kmeňové bunky sa od špecializovaných buniek líšia aj tvarom, je takmer  nemožné identifikovať ich v tkanive iba vizuálne pomocou mikroskopu. Z toho dôvodu sa na ich identifikáciu používajú metódy bunkovej typizácie podľa markerov kmeňových buniek. Pre identifikáciu ľudských MKB, bolo navrhnuté, že ≥ 95% ľudských MKB populácie musí byť pozitívna na expresiu CD73, CD90,  a CD105. Okrem toho  > 98%  populácie ľudských MKB by malo byť negatívnych na expresiu hemopoetických povrchových markerov – CD11b, CD14, CD34, CD45, CD79a alebo CD19 a HLA-DR [3]. Expresia povrchových markerov buniek môže byť ovplyvnená rozličnými vonkajšími faktormi.

V predchádzajúcej štúdii sme sa zamerali na vplyv dlhodobej kultivácie na biologické vlastnosti MKB, vrátane expresie povrchových markerov CD14, CD20, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 a CD133. V prípade MKB izolovaných z pupočníka boli vo viacerých vzorkách z vyšších pasáží zistené zmeny v expresii  niektorých z uvedených markerov.  MKB boli kultivované pri štandardných kultivačných podmienkach (37°C, 5% CO₂ vo vzduchu) s použitím kompletného kultivačného média (D-MEM/Ham´s F12 + 10% FBS). Na uvoľnenie buniek z povrchu kultivačných fliaš bol použitý 1% trypsín. Nakoľko sa jedná o enzým, ktorý špecificky štiepi peptidovú väzbu medzi aminokyselinami arginín a  lyzín, existuje predpoklad, že na zmenenej expresii povrchových markerov MKB sa môže podieľať práve účinok trypsínu.  Na základe týchto zistení sme sa rozhodli porovnať expresiu povrchových markerov MKB, resp. jej zmeny pri použití štyroch rôznych metód uvoľňovania buniek z povrchu kultivačnej fľaše. V prvom rade budú použité dve enzymatické metódy - Trypsín a Akutáza. Na rovnakej vzorke budú použité aj dve neenzymatické metódy. Prvou bude kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) patriaca medzi chelačné činidlá. EDTA  rozrúša bunkové spojenia tým, že odstraňuje Ca²⁺, ktoré integríny potrebujú na udržanie adhézie buniek, neštiepi peptidové väzby.  Ďalšou neenzymatickou metódou bude mechanické zoškrabanie buniek z povrchu fľaše pomocou bunkových škrabiek. Expresia povrchových markerov bude analyzovaná metódou prietokovej cytometrie v každej druhej pasáži.