Karcinóm prsníka patrí k najčastejším nádorovým ochoreniam u žien a tvorí viac ako 25 % zo všetkých typov nádorov vo väčšine európskych krajín. Frekvencia výskytu karcinómov prsníka stúpa so zvyšujúcim sa vekom žien a príčinou vysokej úmrtnosti (>25 %) je metastatické štádium (1,2). Tvorba metastáz prebieha vo viacerých krokoch od lokálnej invázie nádorových buniek, cez následné preniknutie do krvných a lymfatických ciev, prechod krvným systémom, extravazáciu do vzdialených orgánov až po vytvorenie mikro a následne makrometastáz (3). V uvoľňovaní nádorových buniek hrá dôležitú úlohu proces epiteliálno-mezenchymálneho prechodu (EMT), pri ktorom epiteliálne bunky stratia polaritu, bunkové kontakty, zmenia svoje vlastnosti a nadobudnú mezenchymálny charakter (4).
Cieľom práce je hodnotenie metylácie v 6 génoch asociovaných s invazivitou a metastázovaním karcinómov prsníka (uPA, TWIST1, SNAI1, SNAI2, ADAM23, CXCL12). Pre hodnotenie metylácie v regulačných oblastiach génov tzv. promótoroch sme zvolili kvantitatívnu metódu pyrosekvenovania, ktorá spočíva v meraní vyžiareného viditeľného svetla, čo zodpovedá množstvu zaradených nukleotidov do DNA reťazca počas polymerizácie.
Pyrosekvenovanie vyžaduje špecificky navrhnuté primery, na dizajn ktorých sme používali softvér PyroMark Assay Design 2.0 (Qiagen, Germany). Doposiaľ sme vygenerovali sady primerov pre 4 (uPA, TWIST1, SNAI1, SNAI2) zo 6 génov. Následne sme štandardizovali PCR reakcie pre získanie dostatočného množstva PCR produktov. Vytvorili sme nové pyrosekvenačné assay-e, ktoré sme overovali pomocou validačných reakcií na pyrosekvenátore (PyroMark Q24 System). Výsledky overovania sme vyhodnotili pomocou PyroMark Q24 2.0 Software (Qiagen, Germany).
Nakoľko onkologické ochorenia sú spôsobené nahromadením genetických ale aj epigenetických zmien, je štúdium epigenetických odchýlok dôležitou súčasťou onkologického výskumu. Keďže takéto zmeny môžu zohrávať významnú úlohu v tumorigenéze, môžu byť potenciálnymi markermi prognózy a predikcie liečby.
Táto práca bola podporená v rámci projektov: VEGA 2/0092/15, APVV-0076-10, projektu č. 26240220058 na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj, ktorý bol financovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
otazka
Dobry den. predpokladam, ze dnes je asi detekcia rakoviny prsnika zabezpecena kitmi. v com by bolo pyrosekvenovanie vyhodnejsie?
Re: otazka
dobrý deň, my využívame pyrosekvenovanie na hodnotenie metylácie vo vybraných génoch u pacientiek a jedná o zisťovanie metylačných profilov (samozrejme v porovnaní so zdravými kontrolami) a teda sa jedná skôr o hľadanie "prognostického" markeru pre agresívne typy rakoviny. Ale vo všeobecnosti má pyrosekvenovanie výhody hlavne z hľadiska kvantitatívneho určenia metylácie v konkrétnych CpG dinukleotidoch.
Otázka
Musím povedať, že to je veľmi pekná práca a blahoželám k nej (: Zaujímalo by ma výsledky na slide "Genomická DNA izolovaná z krvi pacientky". Uvedená percentá metylácie v promótorov...ej oblasti daného génu znamenajú že subjekt nemá potvrdený výskyt rakoviny (nízké percentá=nízky miera metylácie= neprítomnonť rakoviny)? Aké percento metýlacie v promótore jedného z vašich génov by podľa vašich štandardov bolo možné považované za markantné (10%,20%....atď)? Ak som dobre pochopil miera metylácia v promótoroch vami vybraných génov (ktorých expresia môže viest k vzniku rakoviny ) by mala vypovedať o agresivite rakovinových buniek, však?
Re: Otázka
Dobrý deň ďakujem za hodnotenie aj za záujem. Každá vzorka pochádza od pacientiek a teda žien s už diagnostikovanou rakovinou prsníka. Týmto pacientkám bola pred operáciou a akoukoľvek ličbou odobratá krv a následne po operácií aj vzorka z tumoru. Takže v tomto prípade sa nejedná o diagnostikovanie ochorenia. Ide skôr o to že regulácia génov ktoré sú zapojené v metastázovaní môžu byť riadené epigeneticky (teda napr metyláciou). My sa teda snažíme zistiť či to tak je a preto vždy porovnávame pacientky so zdravými kontrolami (ženy bez nádorového ochorenia) ako aj štatisticky porovnávame namerané hodnoty s klinicko-patologickými parametrami (vek, veľkosť tumoru, štádium...) Takže áno miera metylácie v promótoroch vybraných génov by tak mohla vypovedať o agresivite daného typu nádoru a mohla by tak pojednávať o prognóze pacienta.
Re: Otázka
Dobrý deň ďakujem za hodnotenie aj za záujem. Každá vzorka pochádza od pacientiek a teda žien s už diagnostikovanou rakovinou prsníka. Týmto pacientkám bola pred operáciou a akoukoľvek ličbou odobratá krv a následne po operácií aj vzorka z tumoru. Takže v tomto prípade sa nejedná o diagnostikovanie ochorenia. Ide skôr o to že regulácia génov ktoré sú zapojené v metastázovaní môžu byť riadené epigeneticky (teda napr metyláciou). My sa teda snažíme zistiť či to tak je a preto vždy porovnávame pacientky so zdravými kontrolami (ženy bez nádorového ochorenia) ako aj štatisticky porovnávame namerané hodnoty s klinicko-patologickými parametrami (vek, veľkosť tumoru, štádium...) Takže áno miera metylácie v promótoroch vybraných génov by tak mohla vypovedať o agresivite daného typu nádoru a mohla by tak pojednávať o prognóze pacienta.