Degradácia glykozidov sa v prírode deje predovšetkým ako hydrolýza katalyzovaná glykozidázami, ktoré odštepujú koncový monosacharid za vzniku príslušného voľného sacharidu a aglykónu alebo jednoduchšieho glykozidu. Úplná hydrolýza diglykozidov ako sú rutinozidy, akuminozidy, vicianozidy alebo primeverozidy môže prebiehať sekvenčne, t.j. pôsobením dvoch glykozidáz sa postupne uvoľňujú príslušné monosacharidy, alebo v jednom kroku pomocou diglykozidáz. V tomto prípade dochádza k uvoľneniu celého disacharidu. Tento princíp je typický pre rastlinné enzýmy, avšak existujú aj výnimky. Ako samostatná skupina glykozidhydroláz boli diglykozidázy klasifikované až v roku 2002 (1).
Rutinozidáza alebo rutínhydroláza (EC 3.2.1.168) je diglykozidáza, ktorá štiepi rutinozidy ako rutín alebo hesperidín, v prípade širšej špecificity rozpoznáva aj neohesperidinózu naringínu. Rutinozidázová aktivita bola identifikovaná u pohánky tatárskej (Fagopyrum tataricum) a pohánky jedlej (F. esculentum), avšak v prvom prípade bola výrazne vyššia (2). Rutín (CAS 153-18-4), rovnako ako kvercetín (CAS 117-39-5), ako jeho aglykón, majú významné biologické účinky.
Rutinóza sa v prírode vo voľnej forme vyskytuje zriedkavo a doteraz sa pripravuje iba mierne kyslou alebo enzymatickou hydrolýzou rutinozidov (3). Tento disacharid má potenciálne využitie ako lacná alternatíva voči syntetickým substrátom (ako je napr. p-nitrofenyl-a-L-ramnopyranozid) na stanovenie ramnozidázovej aktivity.
Ako zdroj enzýmu boli použité homogenizované odtučnené semená pohánky tatárskej. Rutín o koncentrácii 5 g/L bol hydrolyzovaný po dobu troch hodín pri 40 °C a 150 rpm. Priebeh reakcie bol monitorovaný pomocou TLC (chloroform:metanol:voda, 12:7:1, v/v/v). Reakčná zmes bola následne filtrovaná. Filtračný koláč obsahoval prevažne kvercetín a zvyšky rastlinnej biomasy. Rutinóza (CAS 90-74-4) obsiahnutá vo filtráte bola purifikovaná chromatograficky na kolóne aktívneho uhlia a s Celitom 545 v pomere 1:1, elúciou gradientom etanolu vo vode. Frakcie obsahujúce rutinózu boli zozbierané, zahustené a zbavené zvyškov vody opakovaným odparovaním s izopropanolom. Podarilo sa dosiahnuť výťažok 79,8 % rutinózy a jej štruktúra bola následne potvrdená pomocou NMR spektroskopie.
Táto práca bola podporená Agentúrou pre Aplikovaný Výskum a Vývoj v rámci zmluvy č. APVV-0846-12 a projektom VEGA č. 2/0138/12.
(1) Masaharu Mizutani, Hidemitsu Nakanishi, Jun-ichi Ema, Seung-Jin Ma, Etsuko Noguchi, Misa Inohara-Ochiai, Masako Fukuchi-Mizutani, Masahiro Nakao, Kanzo Sakata, Cloning of b-primeverosidase from tea leaves, a key enzyme in tea aroma formation. Plant Physiology 130, pg. 2164-2176 (2002), ISSN 0032-0889.
(2) Toshitaka Yasuda, Hiroki Nakagawa, Purification and characterization of the rutin-degrading enzymes in tartary buckwheat seeds. Phytochemistry 37, pg. 133-136 (1994), ISSN 0031-9422.
(3) Le Zhou, Chao Lu, Gai-Ling Wang, Hui-Ling Geng, Jian-Wu Yang, Peng Chen, Syntheses of R-b-rutinosides by rutin-degrading reaction. Journal of Asian Natural Products Research 11, pg. 18-23 (2009), ISSN 1028-6020.
Enzym
Dobry den, Dr. Potocka,
Vasa praca je uplna :-), ale predsa mam otazku, pokusili ste sa izolovat/cistit rutinozidázu z "hrubeho zdroja?"
Vdaka, vela uspechov, P. Farkas
Re: Enzym
Ďakujem za záujem. Existuje niekoľko publikácii zaoberajúcich sa rutinozidázovou aktivitou v pohánke. Napríklad v roku 1994 YASUDA a NAKAGAWA (Phytochemistry 37 (1), p. 133–136) úspešne izolovali tento typ enzýmu. Avšak v našom prípade izolácia nebola ekonomicky atraktívna a vzhľadom k tomu, že ramnozidázová aktivita v testovanej odrode pohánky bola zanedbateľná, tento krok nebol potrebný pre získanie požadovaného produktu.