Expresia a purifikácia ľudského rekombinantného pretrombínu-1 s afinitným His-tagom využitím expresného systému Escherichia coli

Trombín patrí medzi serínové proteázy a zohráva nezastupiteľnú úlohu v kaskáde krvnej koagulácie.  Vystupujúci ako multifunkčný enzým, trombín má niekoľko prekurzorov, medzi ktoré patrí aj pretrombín-1, ktorý sa od protrombínu (dlhší prekurzor) líši absenciou 155 aminokyselinových zvyškov na N-terminálnom konci a pozostáva z polypeptidového reťazca zloženého z fragmentu 2, a A a B trombínového reťazca [1,2,3]. Potenciálom farmaceutického využitia trombínu v klinickej praxi je napríklad príprava lokálneho hemostatika s obsahom trombínu a jeho využitie v rôznych oblastiach chirurgie [4].

V tejto práci sme sa zamerali na produkciu rekombinantného pretrombínu-1 ako jedného z  prekurzorov trombínu v hostiteľských systémoch Escherichia coli. Práve bakteriálny systém E. coli je pomerne často využívaný na produkciu rekombinantných proteínov, nakoľko dokáže v  podmienkach nenáročných na zloženie kultivačného média produkovať veľké množstvo proteínu v  priebehu niekoľkých hodín [5]. Exprimovaný proteín, v našom prípade pretrombín-1, je v tomto prokaryotickom systéme exprimovaný vo veľkom množstve. Ak je expresia príliš rýchla alebo dochádza k nesprávnemu foldingu proteínu, polypeptidové reťazce sa hromadia v cytoplazme a tvoria tzv. inklúzne telieska. Inklúzne telieska tak predstavujú nesolubilné zhluky rekombinantného proteínu. Obrovskou výhodou tohto systému je ochrana proteínu pred bunkovými proteázami a jeho vysoká koncentrácia a čistota v inklúznych telieskach [6,7]. Jednu z nevýhod môže predstavovať isté percento straty pri spätnej revitalizácií cieľového proteínu. Pomocou chaotropných činidiel alebo silných aniónových detergentov je možné rekombinantný proteín solubilizovať z inklúznych teliesok a vhodným pufrom ho opätovne renaturovať [8]. Náš experiment bol zameraný na prípravu konštruktu obsahujúceho cieľový gén pre pretrombín-1 so sekvenciou pre His-tag na N-konci proteínu. V nasledujúcom kroku boli týmto expresným vektorom transformované bunky E. coli BL21ai a optimalizované podmienky expresie. Cieľový proteín sme v najväčšej miere získali v podobe inklúznych teliesok, čim sme potvrdili predchádzajúce experimenty. Nasledovne prebehla izolácia a solubilizácia rekombinantného proteínu z inklúznych teliesok, načo nadviazala purifikácia metódou IMAC na niklovej matrici [9,10].