Amyloidná agregácia proteínov je spojená s mnohými ochoreniami akými sú Alzheimerova choroba, diabetes mellitus a rôzne priónové ochorenia [1]. Molekulárnym základom týchto ochorení sú intermolekulárne interakcie nenatívnych konformérov, ktoré vedú k formovaniu amyloidných agregátov s vysokým obsahom krížovej β-štruktúry [2, 3].
V našej práci sme sa zamerali na štúdium vplyvu Lz - peptidov, krátkych fragmentov ľudského lyzozýmu na amyloidnú agregáciu lyzozýmu. Aminokyselinová sekvencia Lz-peptidov odpovedala amyloidogénnej sekvencii lyzozýmu R107-R115 (Lz peptid) alebo bola modifikovaná zvýšením kladného náboja nahradením Ala2Lys (LzK peptid). Ďalšou modifikáciou Ala5Trp došlo v peptide LzKW okrem zvýšenia náboja, aj k zvýšeniu hydrofobicity. Našim cieľom bolo zistiť, či zmena náboja a/alebo hydrofobicity aminokyselinového reťazca má vplyv na anti-amyloidné vlastnosti Lz-peptidov. Použili sme nato rôzne spektroskopické techniky (viazanie tioflavínu T (ThT) a kruhový dichroizmus (CD)) a atómovú silovú mikroskopiu (AFM).
Výsledky získané pomocou ThT metódy ukazujú, že Lz-peptidy v študovanom koncentračnom rozsahu (10 pM - 1 mM) ovplyvňujú fibrilizáciu ľudského lyzozýmu (10 μM). V prípade Lz a LzK peptidu sme pozorovali postupné znižovanie hodnôt fluorescencie ThT s rastúcou koncentráciou peptidov. Pre koncentrácie vyššie ako 100 nM sme pozorovali pokles fluorescencie k hodnotám 60% (Lz peptid), resp. 50% (LzK peptid) oproti hodnotám detegovaným pre lyzozýmové fibrily samotné (100%, kontrola). Prítomnosť LzKW peptidu nespôsobila výrazné zmeny v hodnotách fluorescencie ThT v celom študovanom rozsahu, čo naznačuje, že LzKW peptid nie je schopný inhibovať amyloidnú agregáciu ľudského lyzozýmu. Účinok Lz-peptidov bol pozorovaný aj pomocou kruhového dichroizmu. CD spektrum fibríl ľudského lyzozýmu (10µM) malo typické spektrum odpovedajúce vysokému obsahu β-listov s lokálnym minimom pri 222 nm. Zmeny v tvare spektier získané po fibrilizácii lyzozýmu v prítomnosti Lz a LzK-peptidov (60µM) poukazujú na nižšie množstvo β-listov a vyšší podiel α-helixov v porovnaní s lyzozýmovými fibrilami. LzKW peptid (60µM) spôsobil len minimálne zmeny spektra oproti lyzozýmovým fibrilám, čo naznačuje podobné zastúpenie prvkov sekundárnej štruktúry. Atómová silová mikroskopia potvrdila výsledky získané metódou viazania ThT. Lyzozýmové fibrily mali typickú morfológiu amyloidných fibríl (dlhé, tenké vlákna). Amyloidná fibrilizácia lyzozýmu v prítomnosti Lz alebo LzK peptidov spôsobila výraznú redukciu množstva amyloidných agregátov. Na druhej strane, v prípade LzKW peptidu sme nepozorovali redukciu ani zmeny v morfológii vznikajúcich fibríl.
Naše výsledky indikujú, že krátke fragmenty lyzozýmu majú schopnosť ovplyvniť tvorbu amyloidných agregátov lyzozýmu, pričom dôležité bolo ich aminokyselinové zloženie. Ukázalo sa, že zvýšenie náboja vo fragmente LzK nespôsobilo zmeny voči aktivite pozorovanej pre Lz peptid. Zvýšenie hydrofobicity fragmentu LzKW viedlo k podstatnému poklesu inhibičnej aktivity v podstate až na minimálnu úroveň. Získané výsledky poukazujú na to, že Lz a LzK peptidy môžu tvoriť základ pre dizajn látok s potenciálnym využitím pri liečbe amyloidných ochorení.
Táto práca bola podporená projektom VEGA 2/018/13.
[1] T. P. Knowles, M. Vendruscolo and C.M. Dobson, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 15 (6) (2014), 384-96.
[2] C. Haass, D.J. Selkoe, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2) (2007), 101-12.
[3] R. S. Harrison, P. C. Sharpe, Y. Singh, D.P. Fairlie, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 159 (2007), 1-77.