Septíny tvoria rodinu vysoko konzervovaných eukaryotických proteínov, ktoré sú dôležitou zložkou cytoskeletu. Septíny majú dôležitú úlohu v cytokinéze a v mnohých bunkových procesoch ako je tvorba difúznej bariéry, vezikulárny transport, exocytóza atď. Tieto GTP proteíny tvoria hetero-oligomérne komplexy skladajúce sa do štruktúr vyššieho rádu, vrátane filamentov a prstencov. Súčasné štúdie poskytli prvé štrukturálne informácie o rôznych úrovniach organizácie septínov, avšak zásadné faktory zodpovedné za poskladanie septínových filamentov do komplexných štruktúr zostávajú nejasné.
Gin4 je serín-treonín proteín kináza, ktorá zohráva dôležitú úlohu v správnej organizácii septínového prstenca, esenciálneho pre hladký priebeh bunkového cyklu [1]. Gin4 je špecificky aktivovaná počas mitózy a tvorí multiproteínový komplex spolu s ďalšími proteínmi. Gin4 proteín kináza priamo fosforyluje septín Shs1 [2] a predpokladá sa, že fosforyláciou Shs1 sprostredkuje svoju aktivitu na septínový komplex.
Naším cieľom bola expresia a purifikácia Gin4 proteín kinázy, ako aj zistenie vplyvu proteín kinázy na tvorbu filamentov a štruktúr vyššieho poriadku septínov.
Gin4 proteín kinázu sme exprimovali v kvasinkách a purifikovaný proteín pridali k purifikovaným septínom značeným fluorescenčným proteínom (izolované podľa Farkašovský a kol., 2005) [3], ktoré vytvárajú filamenty pri nízkych koncentráciach solí (0,1 M KCl) [4]. Na záberoch z fluorescenčného mikroskopu je vidieť, že po pridaní Gin4 proteín kinázy septínové filamenty tvorili komplexné štruktúry a zhlukovali sa, kým po pridaní kinase dead mutantnej formy proteínu, použitého ako negatívna kontrola, sme nezaznamenali zmeny v organizácii septínov.
Proteín kináza Gin4 je dôležitá pre stabilitu a funkciu septínového prstenca, čo je nevyhnutné pre normálnu cytokinézu. Podľa záberov z fluorescenčného mikroskopu predpokladáme, že zosieťovanie septínových filamentov v prítomnosti Gin4 proteín kinázy má pravdepodobne stabilizačnú úlohu a napomáha vytváraniu vysoko organizovanej štruktúry potrebnej na väzbu ďalších proteínov potrebných na presné časovanie procesov mitózy a cytokinézy.
Projekt je financovaný z VEGA grantu 2/0050/11.
[1] Asano, Park, Yu, Zhou, Sakchaisri, Park, Kang, Thorner, Veenstra, Lee, J Biol Chem. 2006, 281(37):27090-27098.
[2] Mortensen, McDonald, Yates, Kellogg, Mol Biol Cell. 2002, 13(6):2091-2105.
[3] Farkašovský, Herter, Voss, Wittinghofer, Biol. Chem. 2005, 386, 643-656.
[4] Bertin, McMurray, Grob, Park, Garcia, Patanwala, Ng, Alber, Thorner, Nogales, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008, 105(24):8274-8279.