Ióny vápnika (Ca2+) sú jedny z najdôležitejších iónov v ľudskom organizme. Významne sa podieľajú aj na excitačno-kontrakčnom prepojení v srdci, ale tiež pri regulácii tvorby ATP v mitochondriách [1,2]. Schopnosť mitochondrií zadržiavať vápnik ako reakcia na výkyvy hladiny vnútrobunkového vápnika, rozhoduje o prežití myocytu počas metabolického poškodenia. Pri závažnom narušení vápnikovej homeostázy sa aktivujú špecifické mitochondriálne póry (MPTP – ang. mitochondrial permeability transition pore), čo vedie k strate membránového potenciálu a v končenom dôsledku k bunkovej smrti [3]. Pri rôznych ochoreniach ovplyvňujúcich srdcovú činnosť môže dochádzať k zníženiu retenčnej schopnosti mitochondrií myokardu. Väčšina štúdií využíva na porovnanie retenčnej kapacity koncentráciu Ca2+ iónov vo vzorke, pri ktorej dochádza k otvoreniu PTP, vyplaveniu Ca2+ do extramitochondriálneho priestoru a kolapsu mitochondriálnej membrány [3,4]. Ako referencia sa často používa inhibítor MPTP – cyklosporín A. V prípadoch, kedy je potrebné študovať vplyv malých koncentrácií Ca2+ na mitochondrie, alebo nie je možné, prípadne nie je žiaduce dosiahnuť stav otvorenia PTP, je potrebné vhodné zvoliť na analýzu iný prístup.
Cieľom práce, bolo predstaviť vhodné alternatívne metódy kvantitatívnej analýzy retenčnej schopnosti mitochondrií. Na rozdiel od štandardne využívaného porovnávania „zlomovej“ koncentrácie Ca2+, pri ktorej dochádza k otvoreniu PTP, sme sa zamerali na priebežnú schopnosť mitochondrií absorbovať a udržiavať Ca2+. V práci sme predstavili metódu analýzy s využitím plochy pod krivkami, ako aj „dose-response“ metódu porovnávania celých časových záznamov. Obe metódy sú vhodné na analyzovanie aj v prípade, že počas experimentu nebol zaznamenaný „zlomový“ bod.
Podporené grantmi VEGA 2/0133/15, APVV-15-0119 a VEGA 2/0121/18; ITMS 26230120006
[1] Szabadkai G. a Duchen M. R., Mitochondria: The Hub of Cellular Ca 2+ Signaling. In: Physiology 23, 2008, s. 84-94.
[2] Maack Ch. a O’Rourke B. Excitation-contraction coupling and mitochondrial energetics. In: Basic Res. Cardiol. 102, 2007, s. 369–392.
[3] Bernardi P. et al., Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. In: The Journal of Biological Chemistry 273, 1998, s. 12662-12668.
[4] O’Rourke B. et al., Dynamics of matrix-free Ca2+ in cardiac mitochondria: two components of Ca2+ uptake and role of phosphate buffering. In: J. Gen. Physiol. Vyd. 139, 2012, s. 465–478.
Otázka
Ahoj Palo,
Pekný jasný a stručný poster. Chcem sa opýtať, okrem metódy analýzy "zlomovej" koncentrácie, existujú v publikáciách iné prístupy, ktoré sú štandardne používané.
Re: Otázka
Ďakujem za reakciu!
Ospravedlňujem sa za oneskorenú reakciu. Nespomínam si že by som sa v literatúre stretol s iným prístupom na analyzovanie. Je ale veľmi pravdepodobné, že v niektorých publikáciach sa naozaj bude možné stretnúť s inými alternatívami vyhodnocovania. Predpokladám však, že v mnohých prípadoch výskumné tímy používajú porovnávanie "zlomovej" koncentrácie práve preto, že je to najrozšírenejšia metóda s ktorou sa v publikáciach dá stretnúť.
doplnky k metodike
Dobry den, mohli by ste, prosim vas, specifikovat ake pristrojove a softwarove vybavenie je potrebne na realizaciu vasej metodiky. Ake dalsie experimenty planujete na verifikaciu tejto metodiky? Vopred dakujem za odpovede, ZB
Re: doplnky k metodike
Ďakujem za otázku.
Čo sa experimentálneho vybavenia týka je potrebné mať k dispozícii fluorescenčný spektrometer, ktorý umožňuje zaznamenávať zmenu fluorescencie v čase. Napríklad, zaznamenáva intenzitu fluorescencie každých 0,1 sekundy. Na spracovávanie je vhodné použiť softwareové prostredie R. To je ideálne na určenie plôch pod krivkami aj rozdielov od "baseline" pri dose-response metóde. Na samotné porovnávanie získaných hodnôt medzi skupinami je možné použiť akýkoľvek software, ktorý umožňuje vytvárať štatistické analýzy, resp. testy, napríklad StatsDirect.
Na verifikáciu sa pripravuje experiment, v ktorom sa budú porovnávať retenčné kapacity mitochondrií od diabetických potkanou, potkanou ktorý boli vystavený umelým ischemickým epizódam (remote ischemic preconditioning) a kontrolných potkanou.