Alzheimerova choroba je najrozšírenejšou formou demencie. Toto neurodegeneratívne ochorenie sa vyznačuje úbytkom neurónov, neurozápalom a prítomnosťou amyloidných plakov a fibrilárnych klbiek zložených z tau proteínu [1]. Základnou zložkou amyloidných plakov je amyloid β, ktorý vzniká z amyloidového prekurzorového proteínu β (APPβ). APPβ sa tvorí v intracelulárnom priestore neurónov a následne sa transportuje k membráne. Jeho funkcia dodnes nie je objasnená. Štiepením β a γ-sekretázou vznikajú z ektocelulárnej domény APPβ hydrofóbne produkty amyloid β40-42, ktoré následne agregujú a vytvárajú amyloidné plaky. Zvýšené množstvo amyloidných plakov zabraňuje bunke prijímať signály z extracelulárneho priestoru a adekvátne reagovať, čo môže vyústiť do oxidatívneho stresu a bunkovej smrti [2].
Cieľom našej práce bolo zistiť, či podanie lipopolysacharidu (LPS) pochádzajúceho z bunkovej steny baktérií, dokáže vyvolať nadprodukciu APPβ v experimentálnom modeli zvierat s narušenou stresovou odpoveďou. Stresová odpoveď je riadená HPA osou, ktorej kľúčovým mediátorom je kortikoliberín (CRH). Použili sme preto kortikoliberín-deficientné myši (CRH-/-), ktoré sme následne vystavili nepredikovateľnému chronickému stresu. Časti zvierat sme na konci experimentu podali vysokú dávku LPS (250 μg/kg hmotnosti zvieraťa). Okrem produkcie APPβ mRNA v kortexe a strednom mozgu (izolovaný spolu s pons Varoli) zvierat sme skúmali aj neurozápalové zmeny, astrocytózu, a aktiváciu mikroglie a perivaskulárnych makrofágov, ako rezidentných fagocytových buniek, ktoré reagujú na amyloid β40-42. Výsledky boli vyhodnotené dvojfaktorovou ANOVA a Bonferonniho post hoc testom (GraphPad Prism 5).
Preukázali sme zvýšenie expresie APP mRNA v kortexe stresovaných CRH-/- myší. U týchto zvierat sme tiež zistili nárast zápalových faktorov (IL1β, IL6), a nárast ďalších markerov, ktoré sú asociované s pretrvávajúcou mikrogliálnou fagocytózou (TREM2, TGFβ1). Predpokladáme, že uvedené nálezy v mozgovej kôre súvisia so zmenenou reguláciou zo stredného mozgu a pons Varoli, kde sme u týchto zvierat zachytili astrocytózu reprezentovanú zvýšeným GFAP, taktiež IL1β, TGFβ1. Kľúčovým v tomto procese môže byť expresia TNFα a IL6, ktorá sa vplyvom nepredikovateľného stresu u CRH-/- signifikantne nemení, resp. expresia vykazuje znížený trend. Avšak po podaní LPS u stresovaných zvierat sa charakter neurozápalu mení, zvyšuje sa expresia TNFα v strednom mozgu a IL6 v kortexe, čo je spojené s nadprodukciou APPβ.
Naša štúdia poukazuje na vplyv HPA osi na vznik neuropatológie súvisiacej s Alzheimerovou chorobou. CRH-/- myši tak môžu predstavovať ďalší model vhodný na skúmanie etiopatogenézy Alzheimerovej choroby.
Práca vznikla za finančnej podpory grantov APVV-0088-10 a VEGA 2/0067/14.
[1] Braak H., Del Tredici K. 2015. The preclinical phase of the pathological process underlying sporadic Alzheimers´s disease. Brain. 138:2814-2833.
[2] Selkoe D.J., Hardy J. 2016. The amyloid hypothesis of Alzheimer´s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8:595-608.
LPS
Dobry den Alexandra , Vas poster ma zaujal a rada by som sa Vas opytala ako sa podalo LPS a aky to malo vyznam v den dekapitacie?
Dakujem
LPS
Dobry den Alexandra , Vas poster ma zaujal a rada by som sa Vas opytala ako sa podalo LPS a aky to malo vyznam v den dekapitacie?
Dakujem
Re: LPS
Dobry den,
LPS sa podavalo intraperitonealne. Povazujeme ho za silny stresor a zaroven za silneho aktivatora imunitneho systemu. Interleukiny dokazuju, ze podanie prebehlo spravne, a co je zaujimave, zvysuje sa hladina APP v kortexe zvierat. Expresia APP je za kazdych okolnosti pomerne vysoka, ale stiepi sa sekretazami na kratke formy amyloidu, ktore su hydrofilne a teda nie su toxicke. V nasich experimentalnyh podmiekach sa expresia APP zvysila a preto predpokladame, ze bezne stiepne enzymy su nasytene substratom a zapoji sa aj dalsi, tzv. gama-sekretaza, ktora z APP vystiepi toxicky hydrofobny amyloid beta42. To nasledne aktivuje gliu a perivaskularne makrofagy v endoteli mozgovych ciev vykazuju zvysenu aktivitu. Nase vysledky poukazuju na ulohu APP v odpovedi mozgu na silny akutny periferny zapal.
LPS
Ahoj,
stres sam o sebe moze sposobovat u hlodavcov stavy podobne demencii a Alzheimerovej chorobe. Preco ste v pokuse podavali navyse este LPS? Dakujem za odpoved.
Re: LPS
Ahoj, dakujem za otazku. Odpoved je trochu dlhsia, komplexna. Alzheimerova choroba sa vyznacuje hlavne neurofibrilarnymi klbkami (zlozene z hyperfoforylovaneho a agregovaneho tau proteinu) a amyloidnymi plakmi ("lepive" formy amyloidu beta 40 a 42 su hydrofobne a preto maju tendenciu viazat na seba ostatne formy amyloidu, pripadne ine makromolekuly). U hlodavcov sa roznymi stresormi moze indukovat tzv. prechodna hyperfosforylacia tau proteinu, najmä pocas neuronalneho vyvoja (Iqbal et al., 2011 PMCID: PMC3090074), anestézie (Planel et al., 2007 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.4854-06.2007) alebo hypotermie a hibernacie (Su et al., 2008 PMCID: PMC3796382). Dodnes nie je jasne, ci sa tento jav vyskytuje aj u ludi.
Tieto javy je zlozite asociovat so vznikom amyloidnych plakov. Na zaklade najnovsich studii (Kumar et al., 2016 DOI: 10.1126/scitranslmed.aaf1059) sme sa rozhodli pouzit mysi, ktorym bola podana jednorazova vysoka davka LPS ako posledny stresor a zaroven na vyvolanie silnej akutnej imunitnej odpovede. A to podla nasich prezentovanych vysledkov ma za nasledok zvysenie expresie amyloidneho prekurzoroveho proteinu u dlhodobo stresovanych mysi s narusenou odpovedou na stres (CRH-/- mysi), kde nase preliminarne dosial neprezentovane vysledky ukazuju iste zmeny aj v tau fosforylacii.
CRH
Dobrý deň Alexandra,
rada by som sa opýtala, či bol vo Vašom experimente gén pre CRH deletovaný a či ste nejakým spôsobom overovali expresiu CRH u CRH-/- myší.
Vopred vďaka za odpoveď.
Re: CRH
Dobry den, dakujem za otazku. Tento kmen mysi ziskal jeden z nasich poprednych vedeckych pracovnikov dr. Kvetnansky „do daru“ pocas rokov, ktore stravil v USA. Kmen vznikol v USA nasledovne: klonovaná genmická DNA korešpondujúca pre CRH lokus bola izolovaná z Balb/c mysi. Pouzity vektor na gene-targeting bol konstruovany tak, aby nahradil celu pre-proCRH kodujucu oblast za tzv. kazetu s neomycinovou rezistenciou. Vektor bol vlozeny do embryonalnych kmenovych buniek. Naslednym krizenim heterozygotov vznikli homozygotne mysi. Kmen je blizsie opisany v publikacii od Venihaki a Majzoub, 2002 (PMID: 12359501). V nasom experimente sme okrem adrenergickych receptorov skumali aj expresiu CRH a jeho receptorov (CRHR1, CRHR2) specifickymi primermi, pricom sme nezaznamenali vyznamne zmeny v expresii CRH a CRHR2 (co neprekvapuje lebo ma vyssiu afinitu na urokotin nez na CRH) ale nasli sme zmeny v CRHR1 v niektorych oblastiach, co koresponduje s chybajucou CRH signalizaciou v mozgu pocas stresovych podmienok. Navyse sa tieto zvierata vyznacuju nizsou telesnou hmotnostou a nachylnostou na rozvoj zapalovych procesov. Preto konstatujeme, ze CRH je u tychto zvierat nefunkcny.
CRH