Úvod: Reverzné transkriptázy (RT) sú retrovírusové replikatívne polymerázy, ktoré slúžia pri syntéze dvojvláknovej DNA z jednovláknového RNA genómu. Sú bežne využívané v molekulárnej diagnostike a biotechnológii. Polymeráza z vírusu myšej leukémie Moloney (MMLV) je najčastejšie používanou RT pri štúdiách RNA [1, 2]. Vibrio natriegens (V. natriegens) je gramnegatívna baktéria, ktorá sa stala sľubným expresným systémom v molekulárnej biológii a biotechnológiách. Má rýchly rast, prirodzenú schopnosť prijímať environmentálnu DNA, tolerovať rôzne kultivačné podmienky a rásť na rôznych zdrojoch uhlíka [3]. Cieľom práce bolo optimalizovať kultivačné podmienky pre produkciu solubilnej MMLV reverznej transkriptázy v kmeni V. natriegens zbavenom profágových oblastí.
Materiál a metódy: Bakteriálny kmeň: V. natriegens s genotypom Δvnp1, Δvnp2. Plazmidy: pJexpress404-RT-mut (ampicilínová rezistencia) a pGro7 (chloramfenikolová rezistencia). Kultivačné médiá: LB3 komplexné médium a 2YT komplexné médium s v2 soľami. Pri transformácii kmeňov V. natriegens sme použili metódu elektroporácie. Maloobjemová expresia v Erlenmeyerových bankách prebiehala 1, 2 a 4 hodiny. Bunky sme homogenizovali ultrazvukovým homogenizátorom. Získané vzorky sme analyzovali pomocou SDS-PAGE. Vyvrane solubilne frakcie sme analyzovali pomocou metody polosucheho western blotu. Aktivita bola potvrdená pomocou dvojkrokovej metódy PCR s reverznou transkripciou.
Výsledky a diskusia: Najvyšší solubilný výťažok bol dokázaný pri 4-hodinovej expresii v 2YTv2 médiu pri 37 °C, optickej hustote buniek pri indukcii expresie 0,8 a výslednej koncentrácie IPTG 1mM a 0,05 % L-arabinózy. Pritomnosť šaperonov, konkretne proteinov GroES a GroEL napomahalo zvyšovať solubilitu reverznej transkriptazy. GroES a GroEL spolu vytvaraju komplex, ktory minimalizuje vznik inkluznych teliesok v cytoplazme buniek. Plazmid pGro7 je významným nástrojom v molekulárnej biológii a biotechnológii. Obsahuje dva šaperónové gény, ktoré zohrávajú kľúčovú úlohu pri solubilite a správnom skladaní rekombinantných proteínov v bakteriálnych bunkách. Po prečistení proteínu pomocou afinitnej chromatografie sme potvrdili aktivitu mutovanej reverznej transkriptázy pomocou dvojkrokovej metódy PCR s reverznou transkripciou.
Záver: optimalizovali sme produkciu MMLV RT v expresnom systéme V. natriegens pod kontrolou T5 promótora.
Príspevok je výsledkom realizácie projektov APVV-22-0161, APVV-21-0215, APVV-20-0284, APVV-19-0196 a APVV-17-0333.
[1] Najmudin, S., Coté, M. L., Sun, D. (2000). Crystal Structures of an N-terminal Fragment from Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Complexed with Nucleic Acid: Functional Implications of Template-primer Binding to the Fingers Domain. 296(2), p. 613.
[2] Oscorbin, I. P., Filipenko, M. L. (2021). M-MuLV reverse transcriptase: Selected properties and improved mutants. 19, p. 6315.
[3] Ozer, E., Alfonta, L. (2021). Genetic Code Expansion of Vibrio natriegens. 9, p. 1.