Úvod: Vďaka výnimočným fyzikálnym a chemickým vlastnostiam, ktoré sú dané vysokým pomerom povrchu a objemu, predstavujú nanočastice sľubný materiál, ktorý svoje využitie nachádza, v mnohých oblastiach súčasnej vedy a techniky, medicínu nevynímajúc. V tejto štúdii sme sa zamerali na ekologicky prijateľnú zelenú syntézu strieborných a zlatých nanočastíc využitím fytochemikálií nachádzajúcich sa v inváznej rastline pohánkovec japonský – Fallopia japonica z čeľade Polygonaceae. Následne sme sledovali antibakteriálnu aktivitu vybraných vzoriek nanočastíc voči bakteriálnym kmeňom Escherichia coli a Staphylococcus aureus.
Materiál a metódy: Extrakty použité na bioredukciu kovových iónov sme pripravili použitím sušiny vňate pohánkovca japonského (Fallopia japonica) a destilovanej vody. Extrakcie boli robené pri laboratórnej teplote a za použitia ultrazvuku (Bandelin Sonorex Digitec, Berlín, Nemecko). Na syntézu kovových nanočastíc (NPs) sme ako prekurzory použili čerstvo pripravené vodné roztoky dusičnanu strieborného (AgNO3, Mikrochem, Slovensko) a kyseliny tetrachlorozlatitej (HAuCl4, Sigma, Aldrich, USA) s koncentráciou 2,2 a 5,5 mM. Priebeh reakcie sme sledovali pomocou UV/Vis spektrofotometra Cary 60 (Agilent Technologies, USA) s Peltierovým blokom (pre dosiahnutie požadovanej reakčnej teploty) v oblasti 750 – 350 nm. Syntéza bola ukončená, keď sme v oblasti okolo 425 nm (pre AgNPs), resp. 540 nm (pre AuNPs) pozorovaný absorpčný pás zodpovedajúci povrchovej plazmónovej rezonancii (Homola, Yee, Gauglitz 1999).
Antibakteriálnu aktivitu sme stanovili s využitím platňovej agarovej difúznej metódy na zásobné kultúry mikroorganizmov Staphylococcus aureus (SA; CCM 4223) a Escherichia coli (EC; CCM 3988), získané z Českej zbierky mikroorganizmov (Brno). Baktérie sme kultivovali v bujóne BHI (Brain Heart Infusion broth, Oxford, Veľká Británia) a inokulovali do tekutého agaru (Oxford, Veľká Británia). Ako pozitívnu kontrolu sme použili gentamicín sulfát, s koncentráciou 50 μg/ml (Sigma Aldrich, USA). Negatívnou kontrolou boli extrakty drogy. Do jamiek s priemerom 5 mm sme pipetovali po 50 μl vzorky, resp. kontroly a platne sme nechali inkubovať 24 hodín pri teplote 37 °C, odfotografovali a stanovili veľkosť inhibičnej zóny použitím softwaru ImageJ (Schneider, Rasband, Eliceiri 2012).
Výsledky a diskusia: Priebeh reakcie sme sledovali spektrofotometricky, ako aj vizuálne – farebnou zmenou. Z hľadiska reakčnej rýchlosti, u Ag nanočastíc reakcia prebiehala niekoľko desiatok minút, dokonca pri použití 2,2 mM roztoku dusičnanu strieborného u niektorých typov extraktu nanočastice nevznikali vôbec, u zlatých NPs trval priebeh menej ako minútu pri všetkých vzorkách.
Antibakteriálnu aktivitu sme stanovili pomocou agarovej difúznej metódy, s použitím vzťahu:
% 𝑅𝐼𝑍𝐷= [(IZDvzorky - IZDneg. kontola)/(IZDpozit.kontrola - IZDneg. kontola)]×100,
kde IZD vyjadruje priemer inhibičnej zóny v mm, a RIZD je podiel priemernej relatívnej inhibičnej zóny v percentách (%).
Výsledky štúdia antibakteriálnej aktivity nám potvrdili významnú antibakteriálnu účinnosť Ag nanočastíc, na rozdiel od zlatých, kedy nebola pozorovaná žiadna zóna inhibície. Nanočastice striebra vykazovali vyššiu antibakteriálnu aktivitu voči gramnegatívnej E. coli, ako proti grampozitívnej S. aureus. U kmeňa E. coli sme pozorovali závislosť koncentrácie roztoku prekurzora od antibakteriálnej aktivity. Najvyššiu antibakteriálnu účinnosť mali vzorky AgNPs pripravené pri laboratórnej teplote a sonifikáciou, s použitím 5,5 mM roztoku dusičnanu strieborného. Aktivita AgNPs, ani samotného roztoku dusičnanu strieborného proti kmeňu S. aureus nedosahovali ani polovicu baktericídneho účinku gentamicínu. U nanočastíc zlata sme antibakteriálnu aktivitu nepozorovali vôbec. Výsledky sú v zhode so závermi štúdií iných autorov (Rathinavel et al. 2020, Shakeel et al. 2016, Tang, Zheng 2018). Extrakty pohánkovca japonského pripravené pri laboratórnej teplote aj sonifikáciou sú vhodné na syntézu zlatých, ale aj strieborných nanočastíc s potenciálom využitia ich antimikrobiálnych vlastností vzhľadom na rastúcu rezistenciu baktérií voči konvenčným antibiotikám.
Táto práca vznikla vďaka finančnej podpore projektu VEGA 2/0112/22 „Vysoko-energetické mletie vaječného odpadu na báze kalcitu a vybraných rastlín pre prípravu nanokryštalických minerálov a environmentálne aplikácie“.
Dobrý deň, zaujala ma Vaša
Dobrý deň, zaujala ma Vaša práca, a koncept zelenej syntézy. Môžete, prosím Vás, ozrejmiť, kedy sa u nás na Slovensku, resp. vo svetovom meradle začalo s týmto prístupom. Mohli by ste stručne popísať jej priebeh a uviesť orientačné výťažky takýchto syntéz? Vopred ďakujem za upresnenia, ZB
Dobrý deň, ďakujem za Vašu
Dobrý deň, ďakujem za Vašu otázku.
Prvé publikácie, ktoré sa venujú syntéze kovových nanočastíc, pochádzajú z roku 2003, pričom ako prvé reduktanty boli použité huby, či škrob. Od tohto roku sa koncept zelenej syntézy rozšíril celosvetovo, s použitím ďalších prírodných materiálov.
Zelená syntéza využíva redukujúce schopnosti látok, prítomných v prírodných materiáloch. Jedná sa napríklad o polysacharidy, proteíny, enzýmy, organické kyseliny a podobne, ktoré sú schopné vytvárať komplexné zmesi. Tieto látky redukujú katióny kovov, prítomných vo forme solí, na ich atómy. Zároveň slúžia ako reverzné micelárne systémy, a sú schopné obklopiť vznikajúcu nanočasticu micelou.
Výťažnosť sme nestanovovali, no vidíme tu priestor na pokračovanie v tejto práci. Pomôcť k určeniu výťažnosti by mohla i komplexnejšia štúdia, ktorá by bola zameraná na charakterizáciu obsahových látok schopných redukcie. Teoreticky, pokiaľ sa zredukuje celý katión, môže byť výťažnosť i 100 %.
Ďakujem veľmi pekne za
Ďakujem veľmi pekne za obšírnu odpoveď. Vidno, že máte nadšenie pre svoju prácu :-) Len tak ďalej, srdečne, ZB
Pekný deň prajem, Môžem sa
Pekný deň prajem, Môžem sa opýtať, aké sú popri výhodách, úskalia prezentovanej syntézy? Napr..množstvo výťažku.. aktivita., porovnatelnost s klasickymi metodami... a podobne.. držím palce k ďalšiemu napredovaniu vo výskume a ďakujem za odpovede. M.
Dobrý deň! Ďakujem za Vašu
Dobrý deň! Ďakujem za Vašu otázku.
Hoci koncept zelenej syntézy prináša so sebou množstvo výhod, nesie i „úskalia“.
Za jedno z nich môžeme považovať kvalitatívne a kvantitatívne zloženie obsahových látok, prítomných v prírodných materiáloch. Rôzny pomer substancií, schopných redukcie, môže viesť k rozdielnej veľkosti častíc, či aktivite. Na to by sme potrebovali charakterizovať redukujúce látky, prítomné v našom prírodnom materiály z rôznych geografických miest výskytu, a porovnať ich zloženie či aktivitu. Táto hypotéza je však zatiaľ len na teoretickej úrovni, no môže byť predmetom ďalšieho výskumu.
Ďalšou z nevýhod je i rôzna veľkosť častíc, ktorá je daná komplexným zložením extraktu. Pri použití chemických, či fyzikálnych ciest syntézy sú častice uniformné.
V neposlednom rade je to i pomerne nízka antibakteriálna aktivita. Hoci je porovnateľná so samotným roztokom dusičnanu strieborného, oproti gentamicínu je oveľa nižšia. „Do praxe“ by sa mohli dostať nanočastice, syntetizované z iných prírodných materiálov, ktorých antibakteriálna aktivita sa približuje k porovnávacej vzorke antibiotika.
A nakoniec, i použitie inváznej rastliny – pohánkovca japonského – nie je v našich podmienkach akceptovateľné. Pre farmaceutické účely sa viac využívajú výsadby monokultúr, v rámci ktorých sú rastliny vystavené rovnakým podmienkam. Pri využití nami použitej rastliny je to neprípustné. Reakcia je reprodukovateľná v domovských krajinách rastliny, v Ázii.
Výhodami tejto syntézy je však ekonomická, environmentálna i prístrojová nenáročnosť, či jednoduchosť postupu. Takto nasyntetizované nanočastice postupne nachádzajú svoje využitie pri dekontaminácií vôd, pôdy, či ochrany odevov, a veríme, že v blízkej budúcnosti tam bude patriť i medicína.