Vitamín D3 sa tvorí v pokožke zo 7-dehydrocholesterolu a v pečeni sa metabolizuje na 25-hydroxyvitamín D3 (25(OH)D3). V obličkách sa ďalej metabolizuje na hormonálnu formu 1α,25‑dihydroxyvitamín D3 (1,25(OH)2D3), ktorá je biologicky aktívna. Hormón 1,25(OH)2D3 generuje biologické odozvy prostredníctvom oboch genomových aj negenomových mechanizmov [1].
Genomový mechanizmus účinku zahŕňa aktiváciu, resp. potlačenie transkripcie. 1,25(OH)2D3 však taktiež vykazuje účinky, ktoré sú príliš rýchle, aby zahŕňali genomový mechanizmus akcie. Predpokladá sa, že tento mechanizmus zahŕňa receptory nachádzajúce sa v membráne v kaveolo-lipidových raftoch, kde sú pripravené k aktivácii kináz, fosfatáz a iónových kanálov. V tejto práci sme sledovali negenomový účinok 1,25(OH)2D3 na aktivitu Ca2+-ATPázy plazmatickej membrány.
Do štúdie bolo zaradených 22 zdravých dobrovoľníkov a 7 pacientov s chronickým ochorením obličiek (CKD) v 2. – 3. štádiu. Membrány erytrocytov boli získané štandardnou metódou Hanahan&Ekholm [2], množstvo bielkovín v membránach bolo stanovené Lowryho metódou [3]. Inkubácia 1,25(OH)2D3 s izolovanými membránami erytrocytov prebiehala 20 min pri 37°C. Aktivita Ca2+‑ATPázy plazmatickej membrány bola stanovená spektrofotometricky ako množstvo vytvoreného anorganického fosfátu na mg bielkovín membrány za hodinu.
Zistili sme, že stredná hodnota aktivity Ca2+-ATPázy plazmatickej membrány erytrocytov zdravých jedincov (n = 22) ako aj pacientov v 2. ‑ 3. štádiu CKD (n = 7) bola signifikantne zvýšená po aplikácii 1,25(OH)2D3 v porovnaní s hodnotou bez aplikácie 1,25(OH)2D3 (P < 0,0001, párový t test). To značí, že 1,25(OH)2D3 má stimulačný účinok na aktivitu Ca2+-ATPázy plazmatickej membrány. U CKD pacientov ide o benefičný účinok nakoľko aktivita Ca2+-ATPázy plazmatickej membrány je u CKD pacientov znížená.
Výsledky našich experimentov ukazujú, že medzi negenomové účinky 1,25(OH)2D3 patrí aj zvýšenie aktivity Ca2+-ATPázy plazmatickej membrány erytrocytov.
Poďakovanie: Táto práca bola vypracovaná vďaka podpore grantov: VEGA 2/0133/15, VEGA 2/0101/12, APVV-0134-12.
[1] Norman A.W. et al., Mol. Endocrinol. 1997, 11(10):1518-31.
[2] Hanahan D.J., Ekholm J.E., Methods Enzymol. 1974, 31, 168-172.
[3] Lowry O.H. et al., J. Biol. Chem. 1951, 193, 265–275.
Variabilita výsledkov
Ahoj Marcela. Opäť pekný a hlavne stručný a výstižný poster :)
V samotnej problematike nie som veľmi doma ale zaujalo ma hneď keď som videl výsledky, že čím by to mohlo byť, že výsledky pacientov majú značne menšiu variabilitu v porovnaní so zdravými kontrolami. Ďakujem.
Re: Variabilita výsledkov
Ahoj Peter, ďakujem za komentár. Ešte by som mohla podotknúť, že nejde o úplne klasický box plot. Boxy predstavujú štandardnú odchýlku a tzv. fúzy minimum a maximumum, teraz som si všimla, že to v prezentácii chýba. Čiže, je to skôr spôsobené extrémnymi hodnotami (min a max), ktoré sa skôr vyskytujú u zdravých dobrovoľníkov, sledovaný parameter je ovplyvňovaný viacerými faktormi (diabetes, hypertenzia...). Je to ale zaujímavé, skôr možno ide o to, že pacienti sú viac sledovaní, zatiaľ čo u zdravých dobrovoľníkov sa môžu objaviť aj spomínané faktory (napr. pacienti s diabetom boli vyslovene zo štúdie vylúčení).
Re: Izoformy a využitie
Ahoj Ivka, ďakujem za komentár. Sú 4 hlavné izoformy PMCA a zaujímavé je, že sú typické pre určité typy buniek. V erytrocytoch (ktoré sme my použili) je izoforma PMCA4, takže by som extrapoláciu výsledkov obmedzila na túto izoformu (stručnosť spôsobila, že táto informácia v texte chýba), ako správne naznačuješ. Ešte stále nie je objasnený mechanizmus účinku (tzv. negenomový), je tiež spájaný s receptorom pre vitamín D (VDR), ale predpokladá sa, že je v inej konfigurácii (ako VDR pri genomovom mechanizme účinku), ktorá by umožňovala väzbu negenomových VDR agonistov. Či sú izoformy štruktúrne a topograficky podobné tak, že by bolo možné očakávať (in vitro) stimulačný účinok testovaného vitamínu je vynikajúca otázka, ale už skôr na iných odborníkov (asi z oblasti molekulovej biológie). Cicavčie PMCA sú kódované štyrmi samostatnými génmi a ďalšie varianty izoforiem sú generalizované pomocou alternatívneho zostrihu RNA primárneho génu pri transkripcii. Sú upravované určitým spôsobom pri vývoji tkanív a buniek určitého typu, čo naznačuje, že tieto čerpadlá sú funkčne prispôsobené fyziologickým potrebám jednotlivých buniek a tkanív. Osobne predpokladám, že by účinok mohol byť podobný (ak by receptor bol aj pri ostatných typoch, ešte sa o tom vie málo), aj keď teoreticky neviem odpovedať a experimentálne sme to neskúšali. A posledná otázka, áno výsledky viedli aj k experimentom suplementácie vitamínu D u pacientov s chronickým ochorením obličiek, ale o tom možno v ďalších ročníkoch konferencie :-).
Re: Re: Izoformy a využitie
Ďakujem, profesionálna odpoveď ma vždy poteší - okrem iného aj preto, že mladí ľudia s podobným prístupom, ako máš Ty, dávajú celej konferencii PREVEDA zmysel. iwa