Osteoartritída (OA) je najčastejšie sa vyskytujúce degeneratívne, zápalové ochorenie kĺbov, ktoré predstavuje celospoločenský problém. V súčasnosti existuje skôr symptomatická liečba, ktorá nerieši príčinu vzniku ochorenia. Preto je žiadúce skúmanie nových terapeutických možností ako aj pochopenie príčiny vzniku a progresie tohto ochorenia. Mezenchymálne kmeňové bunky (MKB) parakrinným vylučovaním rôznych látok (rastových faktorov, chemokínov, cytokínov), či svojim regeneračným potenciálom predstavujú vhodnú alternatívu terapie. MKB okrem vylučovania rôznych imunomodulačných molekúl, vylučujú do prostredia ako aj iné eukaryotické bunky tzv. extracelulárne vezikuly (EV). Exozómy ako podskupina EV sú dôležité v medzibunkovej komunikácii, majú terapeutický potenciál a svojim obsahom (proteínov, lipidov a nekódujúcich nukleových kyselín) reflektujú stav rodičovskej bunky, z ktorej pochádzajú (1). Na skúmanie takýchto nových terapeutických prístupov je potrebné v laboratórnych podmienkach vytvoriť vhodný in vitro model, ktorý bude čo najlepšie simulovať in vivo podmienky OA.
V našej práci sme na vytvorenie in vitro modelu použili synoviálne fibroblasty (SF) izolované zo synoviálnej membrány (SM), ktorá je súčasťou kolenného kĺbu a podieľa sa na progresii OA uvoľňovaním zápalových cytokínov do prostredia kĺbu. SF sme následne aktivovali buď syntetickými cytokínmi ( IL-1β a TNF-α), kondiciovaným médiom (KM) zozbieraným zo SM osteoartritických pacientov alebo exozómami izolovanými z KM. Efekt zápalového prostredia bol analyzovaný na génovej úrovni metódou RT-qPCR. Terapeutický efekt exozómov izolovaných rôznymi metódami z mezenchýmových kmeňových buniek alebo tkaniva choriónu sme sledovali pridaním exozómov k aktivovaným SF po dobu 24/48 hodín. Terapeutický efekt exozómov bol analyzovaný na génovej úrovni metódou RT-qPCR.
Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt Otvorená vedecká komunita pre moderný interdisciplinárny výskum v medicíne (OPENMED), kód ITMS2014+: 313011V455, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja a vďaka Slovenskej grantovej agentúre VEGA 1/0229/20 a APVV-17-0118.
Mohli by ste prosím povedať
Mohli by ste prosím povedať výhody resp. nevýhody získavania a využitia exozómov oproti kondiciovanému médiu ?
Ďakujem.
Ďakujem za otázku. Nevýhodou
Ďakujem za otázku. Nevýhodou získavania exozómov je, že na ich izoláciu v dostatočnom počte je potrebné zozbierať veľké množstvo kondiciovaného média buniek. Okrem toho je dôležité získať exozómy nielen v dostatočnom počte ale aj čistote. V súčasnosti chýba odporúčaný, štandardný postup izolácie. Kondiciované médium obsahuje celý sekrétom buniek, ktorý v in vitro modeli zápalovo aktivoval synoviálne fibroblasty narozdiel od exozómov, ktoré sú súčasťou KM ale neboli schopné zápalovo aktivovať bunky. Exozómy majú veľký potenciál v cell free terapii vďaka nízkemu tumorigénnemu potenciálu, mohli by byť použité ako ,,nosiče" liečiv a ich použitie by malo byť bezpečnejšie. Dôležité je však nájsť vhodnú metodiku izolácie a stanovenie účinnej koncentrácie exozómov.
Ďakujem :)
Ďakujem :)
Dobrý deň. Akou metódou
Dobrý deň. Akou metódou izolujete exozómy? Vďaka za odpoveď.
NK
Dobrý deň, skúšali sme rôzne
Dobrý deň, skúšali sme rôzne izolačné metódy, no momentálne izolujeme exozómy z kondiciovaného média precipitáciou použitím 25% polyetylénglykolu (10% koncentrácia v médiu) a ,,prečistíme" ultracentrifugáciou.
Vďaka za odpoveď a prajem
Vďaka za odpoveď a prajem veľa úspechov.
Ďakujem.
Ďakujem.