Reverzná transkriptáza je málo rozpustný enzým a jeho heterologická produkcia má nízke výťažky. Vysoké množstvá tohto enzýmu v cytoplazme bunky majú tendenciu agregovať a vytvárať inklúzne telieska. Vibrio natriegens má silný proteosyntetický aparát umožňujúci rýchlejší rast biomasy a produkciu cieľového proteínu. V práci sme overili prítomnosť reverznej transkriptázy v kultivačnom médiu počas koexpresie enzýmu s D,D-karboxypeptidázami. Taktiež sme zistili, že 4-hodinová produkcia reverznej transkriptázy u Vibrio natriegens bola účinnejšia ako 24-hodinová produkcia. Okrem toho, syntéza reverznej transkriptázy regulovanej T5 promótorom bola účinnejšia vo Vibrio natriegens ako v Escherichia coli. Množstvá detegovanej extracelulárnej reverznej transkriptázy svedčia o potenciále sekrécie enzýmu do kultivačného média.
Príspevok je výsledkom realizácie projektov APVV-17-0333, APVV-20-0284 a LISPER (ITMS2014:313011V446) na základe podpory operačného programu Integrovaná infraštruktúra financovaného z ERDF. Táto práca bola taktiež čiastočne podporená zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja v rámci projektu USCCCORD (ŽoNFP: NFP313020BUZ3), OP Integrovaná infraštruktúra.
1. Arezi, B., McCarthy, M. a Hogrefe, H.: Mutant of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase exhibits higher resistance to common RT-qPCR inhibitors. Anal. Biochem. 2010. 400: s. 301–303.
2. Thoma, F. et al.: Metabolic engineering of Vibrio natriegens for anaerobic succinate production. Microb. Biotechnol. 2022. 15: s. 1671–1684.
3. Yang, H. et al.: Improving extracellular protein production in Escherichia coli by overexpressing D,D-carboxypeptidase to perturb peptidoglycan network synthesis and structure. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019. 103: 793–806.
4. Pfeifer, E. et al.: Generation of a Prophage-Free Variant of the Fast-Growing Bacterium Vibrio natriegens. Appl. Environ. Microbiol. 2019. 85: s. 853–869.
5. Laemmli, U. K.: SDS-page Laemmli method. Nature 1970. 227: s. 680–685.
Dobrý deň, zaujímalo by ma
Dobrý deň, zaujímalo by ma aký ste zvolili prístup ohľadom dátovej analýzy pre Vami získané výsledky? Ide o jeden samostatný experiment, alebo boli analýzy a merania opakované viackrát? Napr. v jednotlivých časových bodoch na Obr. A, B a C nie sú uvedené chybové úsečky. Použili ste pri vyhodnocovaní aj nejakú štatistickú metódu? Vopred ďakujem za odpoveď, ZB
Vážená pani Brnoliaková,
Vážená pani Brnoliaková,
ďakujem za Vašu otázku. V rámci danej práci išlo o pilotné expresie oboch typov reverznej transkriptázy a pre časové limity sme vykonali experimenty jedenkrát. Nezverejnené výsledky však obsahujú produkciu a následné prečisťovanie mutovaného a nemutovaného enzýmu v troch opakovaniach, kde bola stanovená smerodajná odchýlka pomocou programu Excel.
S pozdravom
Mgr. Ihar Karatkevich
Ďakujem za doplnenie, všetko
Ďakujem za doplnenie, všetko dobré, veľa úspechov v ďalšej experimentálnej práci Vám želá ZB