Izolácia a charakterizácia bakteriofágov infikujúcich multirezistentné Klebsiella spp.

Izolácia a charakterizácia bakteriofágov infikujúcich multirezistentné Klebsiella spp.

Sekcia: 
Rok:
2023

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
67%
Prevedenie (dizajn)
67%
Diskusná interakcia
67%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Bc. Ihar Karatkevich100%100%100%
ISBN: 978-80-974608-0-8

Izolácia a charakterizácia bakteriofágov infikujúcich multirezistentné Klebsiella spp.

Tomáš Talač1 , Andrea Andrésová , Michal Kajsík2,3 ,
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra molekulárnej biológie, Mlynská dolina, Ilkovičova 6, 842 15 Bratislava, Slovenská republika
2 Univerzita Komenského v Bratislave, Vedecký park, Ilkovičova 8, 841 04 Bratislava, Slovenská republika
3 Medirex Group Academy n.o., Novozámocká 1/67, 949 05 Nitra, Slovenská republika
tom.talac@gmail.com

Úvod: Syndróm diabetickej nohy je jednou z najčastejších chronických komplikácií diabetes mellitus a prejavuje sa diabetickými vredmi, ktorých hojenie často komplikujú infekcie spôsobené multirezistentnými baktériami. Antibiotická liečba infikovaných vredov je komplikovaná vzhľadom na trend zvyšujúcej sa rezistencie baktérií a ich biofilmov voči tomuto typu terapie. Do skupiny obávaných multirezistentných baktérií označovanej akronymom ESKAPE patrí aj Klebsiella spp. V súčasnosti je preto potrebný vývoj nových prístupov k liečbe bakteriálnych infekcií [1, 2]. Fágová terapia predstavuje sľubný alternatívny alebo doplnkový prístup k antibiotickej terapii, pretože fágy majú oproti antibiotikám viacero výhod. Medzi najdôležitejšie patrí presné zacielenie liečby na dané patogény a zabránenie vzniku bakteriálnej rezistencie. Pred použitím v terapii musia byť bakteriofágy purifikované a dobre charakterizované, aby sa zabezpečila ich najvyššia bezpečnosť a účinnosť [3].

Ciele: Cieľom práce bola izolácia nových lytických bakteriofágov z odpadových vôd, ktoré infikujú kmene Klebsiella pneumoniae a Klebsiella oxytoca získané z vredov diabetickej nohy, s následnou purifikáciou a fenotypovou aj genomickou charakterizáciou týchto fágov za účelom ich potenciálneho využitia vo fágovej terapii.

Metodika: Počas experimentov sme používali metódy izolácie bakteriofágov z odpadovej vody, amplifikácie fágov a stanovenia fágového titra na dvojitom agare. Purifikáciu fágov sme dosiahli viacnásobným odpichnutím jednotlivých plakov z dvojitého agaru, zrážaním bakteriofágov polyetylénglykolom a ultracentrifugáciou fágov v hustotnom gradiente CsCl s následnou dialýzou. Purifikované fágy sme použili na stanovenie hostiteľskej špecificity, teplotnej stability a adsorpcie bakteriofágov. Určili sme optimálnu multiplicitu infekcie (MOI), životný cyklus a antimikrobiálnu aktivitu fágov v tekutom živnom médiu. Pri charakterizácii fágov sme izolovali fágovú DNA pomocou Phage DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp., Kanada). Purifikované DNA sme sekvenovali pomocou prístroja MiSeq (Illumina, USA) s použitím v2 300 cyklovej chémie a Nextera XT protokolu na prípravu knižnice krátkych čítaní. Celogenómové sekvencie sme použili na taxonomické zaradenie fágov a anotáciu ich genómov.

Výsledky: Z ČOV sme izolovali 3 bakteriofágy, ktoré sme purifikovali v hustotnom gradiente CsCl. Najširšie spektrum hostiteľov mal fág vB_Kox_VP25, ktorý lyzoval 20,55 % zo 73 testovaných kmeňov. Všetky fágy infikovali kmene Klebsiella spp. a Cronobacter spp. Najvyššiu mieru adsorpcie počas 10 min. preukázal fág vB_Kpn_VP23 (98,06 %). Teplotne najstabilnejší pri 37 °C bol fág vB_Kox_VP24, pri 70 °C fág vB_Kox_VP25. Najdlhší životný cyklus mal fág vB_Kpn_VP23, najkratší fág vB_Kox_VP24 a najviac častíc na bunku produkoval fág vB_Kox_VP25. Najvyššiu antimikrobiálnu aktivitu in vitro preukázal fág vB_Kox_VP25, pričom z pôvodnej bakteriálnej populácie prežívalo po 6 hod. len 4,03 – 14,70 % buniek. Prístupmi NGS sme získali celogenómové sekvencie fágov, ktoré sme anotovali a vytvorili fylogenetický strom príbuznosti. Najbližší príbuzný k vB_Kpn_VP23 bol Klebsiella fág KP36 (Webervirus), v prípade vB_Kox_VP24 a vB_Kox_VP25 to bol Klebsiella fág VLCpiA1g (Drulisvirus).

Záver: Fág vB_Kpn_VP23 má potenciál byť temperovaný, a preto nie vhodný pre fágovú terapiu. Najlepšie vlastnosti preukázal fág vB_Kox_VP25 a spolu s vB_Kox_VP24 majú potenciálne terapeutické využitie.

Poďakovanie: 

Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Výskum a vývoj využiteľnosti autonómnych lietajúcich prostriedkov v boji proti pandémii spôsobenej COVID-19, kód ITMS: 313011ATR9, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Zdroje: 

[1] Brocco E., Ninkovic S., Marin M., et al. (2018) J. Cardiovasc. Surg. 59(5), p. 670.

[2] Mulani M. S., Kamble E. E., Kumkar S. N., et al. (2019) Front. Microbiol. 10(539), p. 1.

[3] Duplessis C. A., Biswas B. A. (2020) Antibiotics 9(7), p. 377.

Diskusia

Prajeme pekný deň, Vážený pán Talac, dovoľte mi v mene celého organizačného tímu Preveda pogratulovať Vám k skvelému úspechu. 

V aktuálnom ročníku konferencie sme vašu štúdiu vybrali medzi ocenené práce. 

Prajeme Vám a celému autorskému kolektívu veľa úspechov v napredovaní vášho výskumu. Držíme Vám palce a veríme, že sa s nami vy, prípadne vaši kolegovia podelíte so skvelými výsledkami aj v ďalších ročníkoch Interaktívnej Konferencie Mladých Vedcov.

Ešte raz gratulujeme! V priebehu najbližších týždňov Vám zašleme výhru v podobe malého darčeka. Tím OZ Preveda!

Kliknutím na odkaz si môžete stiahnuť diplom.

Dobrý deň,

ďakujem veľmi pekne za ocenenie našej práce, za diplom a malý darček. Aj v ďalších ročníkoch Interaktívnej Konferencie Mladých Vedcov sa s Vami veľmi rád podelím o naše najnovšie výsledky.

Všetko dobré želá 

Tomáš Talač