Mikroorganizmy rezistentné voči antibiotikám sú dôvodom obáv mnohých odvetí. Postupné rozširovanie rezistentných baktérií v životnom prostredí sa stáva hrozbou pre zdravie človeka. Väčšinou sa rezistencia voči antibiotikám vyvíja, resp. zvyšuje v dôsledku génovej mutácie alebo expresie exogénneho genetického materiálu, ktorý bol získaný a vložený do pôvodného genómu, ako aj klonálnou disemináciou. V našej práci sme sa zamerali na analýzu stabilizovaných kalov z komunálnych čistiarní odpadových vôd (ČOV) z hľadiska prítomnosti koliformných baktérií a ich odolnosti voči antibiotikám. Tendencia rastu aplikácie stabilizovaného kalu do poľnohospodárskej pôdy, hlavne kvôli efektívnemu využitiu kalu ako hnojiva, nesie so sebou aj nepreskúmané nástrahy mikrosveta. Aj napriek tomu, že ČOV využívajú viaceré biologické či mechanické procesy slúžiace na prečistenie kalov a jeho stabilizáciu, kal na výstupe z ČOV môže obsahovať mikropolutanty, ktoré nie sú legislatívne sledované. Preto sme sa zamerali na monitoring rezistentných Escherichia coli (čeľaď Enterobacteriaceae), kde prevažná väčšina jej kmeňov je stálou súčasťou črevnej mikroflóry ľudí a zvierat. Vzorky stabilizovaného kalu sme odoberali z dvoch bratislavských ČOV a to ČOV Bratislava – Vrakuňa (kal 1) a ČOV Bratislava – Petržalka (kal 2). Na kultiváciu sme použili selektívne diagnostické živné médium (Chromocult agar), pričom na selekciu rezistentných kmeňov boli do média pridané rôzne antibiotiká (ampicilín, gentamicín, tetracyklín, ciprofloxacín, chloramfenikol). Koncentrácie antibiotík boli zvolené na základe hraníc rezistencie dané európskymi štandardmi podľa EUCAST ako aj americkými podľa CLSI. Celkový počet E. coli vo vzorkách kalu bol približne 107 KTJ/g, pričom v oboch vzorkách prevažovali hlavne rezistenty voči ampicilínu a gentamicínu (105 – 106 KTJ/g). Následne sme z najvyšších koncentrácií izolovali jednotlivé kmene E. coli, a stanovili ich citlivosť na ostatné antibiotiká. Najvyššia miera rezistencie u všetkých izolovaných kmeňov bola pozorovaná v prípade ampicilínu, kedy väčšina kmeňov odolávala aj koncentrácii 200 μg/ml. Kmene izolované z kalu 2 vykazovali vyššiu odolnosť voči antibiotikám a až 60% z nich bolo multirezistentných. Kmene izolované z kalu 1 mali iba o 10% nižšiu multirezistenciu. V druhej časti práce sme detegovali schopnosť tvorby biofilmu izolovaných rezistentných kmeňov E. coli v porovnaní s modelovou E. coli. Ako pozitívna kontrola bol použitý zbierkový kmeň Pseudomonas aeruginosa. Najvyššiu schopnosť tvorby biofilmu sme zaznamenali u izolátu z kalu 1, ktorý zároveň vykazoval vysokú rezistenciu voči ampicilínu. Izoláty z kalu 2 vykazovali prevažne podobné hodnoty biofilmu ako zbierková E. coli.
Poďakovanie: Práca vznikla za finančnej podpory Agentúry pre podporu vedy a výskumu APVV-0122-12 a za finančnej podpory Programu na podporu mladých výskumníkov STU č. grantu 1387
otazka
zdravim, gratulujem k zaujimavej praci, ktorej problematiky je vysoko aktualna. Chcel by som sa opytat, ako si vysvetlujete vyssiu rezistenciu u kmenov z kalu z petrzalskej cisticky? Myslite, ze za to moze pritomnost nemocnice v spadovej oblasti cistiarne? Ako si vysvetlujete naopak vyssiu aktivitu pri tvorbe biofilmu v kale z vrakune? Uvazovali ste aj o analyze ostatnych bakterialnych kmenov pritomnych v kale pripadne ich rezistencie? cim si vysvetlujete prave vysoku rezistenciu k ampicilinu? dakujem pekne za odpoved
Re: otazka
Dobrý deň, ďakujem za otázky.
K zvýšenej rezistencii môžu prispievať ATB v subinhibičných koncentráciách, ktoré sme na prítoku tiež stanovili, najmä ciprofloxacin, klaritromycin a aj niektoré sulfonamidy.
Čo sa týka vyššej rezistencie kmeňov petržalského kalu, tak určite má na to vplyv aj nemocnica, na to poukázali aj naše prvé výsledky, kde sme zistili vyššiu prevalenciu rezistentných kmeňov. Navyše nemocnica sa nachádza hneď pred čistiarňou, takže sa dostane určite vyšší počet rezistentov na čistiareň a nestihnú sa prichytiť o kanalizáciu alebo byť degradované. Ďalej to môže byť spôsobené aj obdobím, z ktorej je vzorka odobratá, nakoľko vrakunský kal je z januára a petržalský z marca.
Čo sa týka tvorby biofilmu z izolovaných kmeňov z kalu, tak ČOV-Vrakuňa je najväčšia ČOV na Slovensku a priteká na ňu veľa rôznych farmaceutík, ktoré môžu vplývať na qorum sensing baktérií a tým aj ovplyvňovať gény zodpovedné za tvorbu biofilmu. Toto je len počiatočný skrining, kde bolo z každej vzorky izolovaných len 10 izolantov a pre lepšie štatistické dokazovanie by bolo vhodnejšie mať vyšší počet izolantov, o čom uvažujeme do budúcna.
Okrem koliformných baktérií stanovujeme aj enterokoky a S. aureus a ich rezistenciu, o ďalších zatiaľ neuvažujeme.
Vysokú rezistenciu voči ampicilinu si vysvetľujeme jednak tým, že beta-laktámové ATB sú veľmi široko predpisované na Slovensku, čím teda môže ľahšie vznikať rezistencia voči ním a teda aj voči ampicilinu. Navyše je známe, že mnohé kmene gramnegatívnych baktérií produkujú široké spektrum beta-laktamáz, čo chceme v budúcnosti u týchto kmeňov ďalej študovať