Za jeden z najnebezpečnejších typov poškodenia DNA vznikajúcich v dôsledku pôsobenia rôznych endogénnych a exogénnych faktorov sú považované dvojvláknové zlomy DNA (DSB; Double-Strand Break). Zatiaľ čo neopravené DSBs vedú k bunkovej smrti, zle opravené DSBs často zapríčiňujú nestabilitu genómu, ktorá je považovaná za hlavnú hnaciu silu pri vzniku nádorov. Na prekonanie nebezpečenstva, ktoré DSB predstavujú, sa bunkám vyvinuli vysoko sofistikované opravné mechanizmy: homologická rekombinácia (HR; Homologous Recombination) a spájanie nehomologických koncov (NHEJ; Non-Homologous End Joining). Zatiaľ čo HR vyžaduje homologickú sekvenciu pre opravu, NHEJ opravuje DSBs priamou ligáciou koncov. Stále viac sa do popredia v oprave DSBs dostáva aj úloha post-translačných modifikácií, ktoré môžu ovplyvňovať proteínové funkcie a regulovať opravné mechanizmy. V našej práci sa zaoberáme súhrou post-translačných modifikácii ligačného komplexu NHEJ. Ligačný komplex u S. cerevisiae pozostáva z ligázy Dnl4 a proteínov Lif1 a Nej1. Preukázalo sa, že Lif1 proteín podlieha SUMOylácii a ako hlavné SUMOylačné miesto sa javí lyzín v pozícii 301 [1]. Táto SUMOylácia funguje ako negatívny, na bunkovom cykle nezávislý regulátor NHEJ. Proteín Lif1 je tiež fosforylovaný na seríne 383 [2] a seríne 261 [3]. Pripravili sme mutantné kmene kvasiniek, nesúce rôzne kombinácie zámien aminokyselín v miestach, o ktorých bolo preukázané, že podliehajú fosforylácii alebo SUMOylácii. Na takto pripravených transformantoch sme následne merali účinnosť NHEJ v synchronizovaných kultúrach, ako i v jednotlivých fázach bunkového cyklu, s cieľom prispieť k porozumeniu súhry post-translačných modifikácií v oprave DSBs mechanizmom NHEJ.
Táto práca vznikla za podpory z Agentúry na podporu výskumu a vývoja (grantyčíslo APVV –0057–10 a APVV-14-0783) a vedeckej grantovej agentúry Ministerstva školstva SR a Slovenskej akadémie vied (VEGA 2/0056/14).
[1] Vigašová, Nucleic Acids Res., 2013, 41, 5341-5353.
[2] Matsuzaki, Genetics, 2008, 179, 213-225.
[3] Matsuzaki, Genes Cells, 2012, 17, 473-493.
marker
Prajem pekny den, naozaj velmi skvela a zaujimava praca. Chcel by som sa opytat, ako daleko je v ramci danej studii potencialne vyuzitie ako onko-markera? Prajem vela uspechov do dalsieho napredovania.
Re: marker
Dobry den, dakujem velmi pekne. Nasa studia sa zameriava na zakladny vyskum. Post-translacne modifikacie sa vyuzivaju aj ako onko-markery, neviem vsak zatial o prikladoch, kde by sa vyuzivali komponenty ligacneho komplexu z NHEJ. Ja osobne si myslim, ze nasa praca zatial nevedie k potencionalnemu vyuzitiu ako onko-markerov. Je vsak zname ze ligacny komplex podlieha post-translacnym modifikaciam aj v cicavcich bunkach, bolo by preto naozaj zaujimave pozriet sa na tieto modifikacie v cicavcich zdravych aj nadorovych bunkach.
Ser383
Aj mne sa praca velmi paci. :) Najma vidiet, ze k maximalnemu efektu je potrebne, aby Lys301 nebol SUMOylovany a Ser261 bol fosforylovany, resp. neSUMOylovany Lys301 a pozmeneny Ser383. Pri Ser383 je ta "zahadna" cast, ze preco ma rovnaky efekt aj Ser383Ala, aj Ser383Glu, ked sa ocakava, ze by mali posobit opacne. Mate na to nejake vysvetlenie? A kedze som nikdy nerobila s kvasinkami, chcem sa este opytat, ako boli mutanty pripravovane. Je zmutovany endogenny Lif1? Dakujem!
Re: Ser383
Dobry den, dakujem pekne a ospravedlnujem sa za neskorsiu reakciu. Ser383 ma naozaj rovnaky efekt pri zamene za Ala aj Glu, co sa moze vysvetlit napr. tak, ze pri zmene aminokyselin doslo k zmene v strukture, ktora mohla sposobit taky rozdiel v ucinnosti NHEJ. Teda miesto zavedenia mutacie je dolezite, pre samotnu fosforylaciu je to vsak nespecificke. K presnejsiemu dovodu sme sa vsak zatial este v nasej praci nedostali.
Mutanty boli pripravene tak, ze sa pripravil zmutovany Lif1 site-directed mutagenezou. Nasledne sa namnozil pomocou PCR a natransformoval do Lif1::URA3 buniek. Pomocou FOA selekcie boli izolovane a analyzovane narastene transformanty. Takze pomocou homologickej rekombinacie doslo k zamene URA3 za mutovany Lif1 v genome.