Kolorektálny karcinóm (KRK) je tretím najčastejším typom rakoviny v rozvinutých krajinách so štvrtou najvyššou mortalitou spomedzi všetkých onkologických ochorení [1]. Príčinou vysokej mortality je oneskorená diagnóza. Ak sa však nádor zachytí včas je veľmi dobre liečiteľný. Glykozylačné zmeny asociované s onkogénou transformáciou boli prvý krát popísané pred viac ako 60-timi rokmi [2,3]. Glykány sú zahrnuté v základných molekulárnych a bunkových biologických procesoch vyskytujúcich sa v nádoroch, ako napríklad bunková signalizácia a komunikácia, disociácia a invázia nádorových buniek, interakcie bunka-matrix, angiogenéza, modulácia imunity a tvorba metastáz. Nádorové bunky predstavujú široký rozsah glykozylačných zmien v porovnaní s ich netransformovanými náprotivkami. Preto množstvo a kvalita glykozylácie, ako aj zmeny v glykánových štruktúrach môžu slúžiť ako dôležité biomarkery signalizujúce nástup a priebeh mnohých ochorení. Glykoprofilácia by tak mohla slúžiť ako nástroj pre skorú diagnostiku. Cieľom tejto práce bol vývoj, optimalizácia a aplikácia glykoproteínovej microarray využívajúcej lektíny pre glykoprofiláciu potencionálnych biomarkerov KRK súvisiacich s IGF (insuline-like growth factor) systémom a detekcia glykozylačných zmien u pacientov s KRK. Na analýzu glykozylačného profilu sme použili glykoproteínovú microarray využívajúcu lektíny, proteíny, ktoré sú schopné špecificky a reverzibilne viazať glykány. Vzorky obsahujúce glykoproteíny boli najprv nanesené na povrch microarray čipu pomocou robotického microarray printera a následne boli imobilizované s využitím vhodnej povrchovej chémie, pričom po imobilizácii sa zablokovali neobsadené aktívne skupiny na povrchu čipu. Detekcia glykánových štruktúr bola založená na biorozpoznávaní pomocou lektínov, ktoré špecificky interagujú s glykánovými štruktúrami [4]. Po inkubácii pripaveného biočipu s biotinylovanými lektínmi, a v ďalšom kroku s konjugátom stretavidín – fluorofór, bola detegovaná intenzita signálu pre jednotlivé vzorky pomocou microarray skeneru. Glykoproteínovú microarray využívajúcu lektíny sme použili na sledovanie glykozylačných zmien potencionálnych biomarkerov vo vzorkách proteínov IGF systému, IGFBP-3 (IGF-binding protein 3), IGF 1R (IGF 1 receptor) a IGF 2R (IGF 2 receptor). Vzorky boli izolované zo: (i) sér pacientov s KRK a zdravých jedincov, (ii) cytozolovej frakcie získanej z nádorového a zdravého črevného tkaniva pacientov s KRK a (iii) frakcie membránových proteínov získanej z nádorového a zdravého črevného tkaniva pacientov s KRK.
Táto práca bola realizovaná vďaka bilaterálnym grantom APVV-SK-SRB-2013-0028 a 451-03-545/2015-09/01.
1. Ferlay, J., et al., Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer, 2015. 136(5): p. E359-E386.
2. Hakomori, S.I. and W.T. Murakami, Glycolipids of hamster fibroblasts and derived malignant-transformed cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1968. 59(1): p. 254-261.
3. Ladenson, R.P., S.O. Schwartz, and A.C. Ivy, INCIDENCE OF THE BLOOD GROUPS AND THE SECRETOR FACTOR IN PATIENTS WITH PERNICIOUS ANEMIA AND STOMACH CARCINOMA. The American Journal of the Medical Sciences, 1949. 217(2): p. 194-197.
4. Katrlík, J., et al., Glycan and lectin microarrays for glycomics and medicinal applications. Medicinal Research Reviews, 2010. 30(2): p. 394-418.
Otázka
Chcela by som sa spýtať prečo ste si ako ak potencionálne biomarkery vybrali práve IGF? Mohli by ste tiež stručne zhrnúť načo kokrétne poukazujú Vaše závery? Ďakujem.
Re: Otázka
Ďakujem za otázky. Potencionálne glykobiomarkery vyberáme na základe prehľadu literatúry doterajších sledovaných glykoproteínov v KRK. Zohľadňujeme však koncentráciu glykoproteínu v sére, aby nebola príliš nízka (limitná ng/ml), tiež počet glykozylačných miest a dostupnosť protilátky voči sledovanému glykoproteínu.
V skratke k záveru: úspešne sme aplikovali glykánovú microarray využívajúcu lektíny, pričom ide o rýchlu a výkonnú glykorozpoznávajúcu techniku, ktorá dokáže odlíšiť glykozylačné vzory v rôznych typoch vzoriek.
Pacienti a zámer
Dobrý deň Martina, nenašla som charakteristiku pacientov - v akom štádiu ochorenia sa nachádzali? Obecne je molekulárna diagnostika málo senzitívna v počiatočných štádiách nádorového procesu - a v čase, keď sa rozvinú príznaky, je obvykle indikované kolonoskopické vyšetrenie a histologické vyšetrenie odobraného materiálu. Aká je predstava a hlavný motor výskumného zámeru? Je to potenciál diagnostického alebo skríningového testu?
Ešte by ma zaujímalo, na ktorej časti výskumu sa konkrétne podieľate, keďže je uvedených neštandardne veľa spoluautorov.
Ďakujem a prajem úspešnú spoluprácu.
iwa
Re: Pacienti a zámer
Ďakujem za otázky Iveta. Sérum aj nádorové/zdravé tkanivo bolo získané od pacientov, ktorí boli diagnostikovaní a liečení v Clinical-Medical-Center Bežanijska kosa v Belehrade. Pacienti boli klasifikovaní podľa Dukesa, a to v štádiách B (nádor prerastá do okolia) a C (infiltrácia regionálnych lymfatických uzlín karcinómom).
Náš výskum sa zameriava na tvorbu biosenzorov s potenciálnym využitím v skorej diagnostike onkologických ochorení.
Môj podiel na tejto práci je analýza všetkých vzoriek technikou microarray, spracovanie výsledkov z tejto techniky a štatistické spracovanie výsledkov vzoriek IGF 1R a 2R.
Re: Re: Pacienti a zámer
Ďakujem za odpoveď Martina a želám veľa úspechov v tejto dôležitej oblasti onkologickej diagnostiky (pomaly nie je na Slovensku rodina, v ktorej by sa táto diagnóza nevyskytla :( Výskum nepochybne prispieva k posunu k tzv. personalizovanej medicíne.
Iwa