Vplyv vysokých dávok ionizujúceho žiarenia (IR) na DNA je dlhodobo skúmaný a dostatočne známy. Človek sa však vo svojom životnom prostredí často stretáva s pôsobením nízkych dávok IR, ktorých zdrojom sú napr. roentgenové žiariče, počítačové tomografy, emisné tomografy, mamografy a z prírodných napr. kozmické žiarenie. Nízke dávky IR (1-10 cGy) môžu mať v  organizme kumulatívny efekt v podobe poškodenej DNA. Jedny z najzavážnejších poškodení DNA - dvojreťazcové zlomy (DSB) sa u cicavcov najčastejšie opravujú nehomologickým spájaním koncov, za aktívnej interakcie s opravnými a signalizačnými proteínmi. V našej štúdii sledujeme tumor suppressor p53 binding protein 1 (53BP1), ktorý je kľúčovým regulátorom opravy dvojvláknových zlomov (Noon and Goodarzi 2011), vplýva na uprednostnenie nehomologického spájania koncov (NHEJ) a potlačenie homologickej rekombinácie (HDR). Zároveň sledujeme  fosforylovaný proteín histone 2A family member X (γH2AX), ktorý sa uplatňuje pri organizácii eukaryotického chromatínu (Bonner, Redon et al. 2008) a je fosforylovaný na serínoch v oblasti dvojvláknových zlomov kinázami ATM, ATR a DNA-PK (Rogakou, Boon et al. 1999). Tieto proteíny dokážeme v bunkách efektívne vizualizovať pomocou flourescenčných markerov a následne kvantifikovať ako DNA opravné fokusy.

DSB patria k najdôležitejším molekulárnym poškodeniam vedúcim k tvorbe chromozómových translokácií/génových fúzií. Pokiaľ sa vyskytne translokácia v niektorom z protoonkogénov alebo antionkogénov, môže dôjsť k zmene ich funkcie, alebo aktivity a následne k transformácii bunky na nádorovú. Pri leukémii sa predpokladá, že dochádza k prvej udalosti – vzniku translokácie in utero v niektorom z génov kmeňových buniek. Následne sa z takejto kmeňovej bunky diferencuje rad krvotvorných buniek. Čím skôr sa tak stane, tým viac buniek nesie translokácie. Pokiaľ dôjde k druhej udalosti (translokácii) niekde inde v genóme, tá nie je schopná sa optimálne opraviť, čo vedie ku vzniku detskej akútnej lymfoblastickej leukémie (ALL) alebo akútnej myeloblastickej leukémie (AML) (Mori, Colman et al. 2002; Greaves and Wiemels 2003). Stanovenie DSB v bunkách pupočníkovej krvi po pôsobení nízkych dávok IR môže tak prispieť k štúdiu mechanizmov vzniku leukémie u detí.

Na kvantifikáciu DNA opravných fokusov, ich kolokalizáciu pomocou proteínov γH2AX a 53BP1 a fluorescenčne značených sekundárnych protilátok, boli použité čerstvé aj zamrazené bunky izolované z pupočníkovej krvi. Mikroskopické preparáty buniek po imunologickom farbení boli skenované automatizovaným Metafer systémom a následne vyhodnotené pomocou softvéru JCountPro. Výsledky boli porovnané s predchádzajúcou štúdiou, kde boli rovnaké bunky analyzované softwérom MetaCyte (Vokálová, 2014).

Analyzované bunky vykázali zvýšenú tvorbu DNA opravných fokusov v závislosti od dávky IR, pričom štatisticky významný efekt s použitím aritmetického priemeru sme zaznamenali pri dávke 5cGy pre proteíny 53BP1 (Ttest, p = 0,008) a γH2AX (Ttest, p = 0,041), zatiaľ čo pri kolokalizácii 53BP1/γH2AX sme zaznamenali štatisticky významný efekt už pri dávke 2 cGy (Ttest, p = 0,028). S použitím Poissonovho priemeru sme zaznamenali štatisticky významný efekt u 53BP1 (Ttest, p = 0,016) a γH2AX (Ttest, p = 0,048) už pri dávke 2cGy. Signifikantný rozdiel v tvorbe DNA opravných fokusov medzi hematopoetickými kmeňovými bunkami (s markerom CD34+) a ich diferencovaným potomstvom (CD34-) sa nám však nepodarilo preukázať.

V našej štúdii sa podarilo overiť vplyv nízkych dávok IR na zmrazené bunky pupočníkovej krvi už od dávky 2 cGy, a zároveň sa nám potvrdilo, že program JCountPro je vhodný na kvantifikáciu radiačne indukovaných fokusov v bunkách po ožiarení nízkymi dávkami IR.