Expresia alkoholdehydrogenázy vo Vibrio natriegens

Expresia alkoholdehydrogenázy vo Vibrio natriegens

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
60%
Prevedenie (dizajn)
50%
Diskusná interakcia
80%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
PharmDr. Štefan Husár PhD.60%60%-
Ing. Zuzana Brnoliaková PhD.60%40%80%
ISBN: 978-80-972360-4-5

Expresia alkoholdehydrogenázy vo Vibrio natriegens

Kristína Macáková1 , Silvia Rybecká , Eva Struhárňanská , Monika Chovanová , Ľubica Kormanová , Viktor Varga , Zdenko Levarski2 , Stanislav Stuchlík ,
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra molekulárnej biológie, Mlynská dolina , Ilkovičova 6, 842 15 Bratislava, Slovenská republika
2 Univerzita Komenského v Bratislave, Vedecký park, Ilkovičova 8, 841 04 Bratislava, Slovenská republika
kikusamacakova@gmail.com

Vibrio natriegens je gramengatívna, nepatogénna baktéria, ktorá je charakteristická svojou rýchlou generačnou dobou,< 10 min a vysokým obsahom ribozomálnej DNA. V našom experimente sme pracovali s komerčne dostupným kmeňom V. natriegenes s názvom VmaxTMExpress, ktorý je charakteristický deléciou niekoľkých génov extracelulárnych nukleáz a obsahom IPTG indukovateľnú T7-RNA polymerázovú kazetu [1]. Jedná sa o ľahko kultivovateľnú baktériu, na ktorú je možné aplikovať rovnaké techniky zaobchádzania ako v prípade E. coli. Uvedené vlastnosti by mohli viesť ku zníženiu časovej náročnosti a zefektívneniu ekonomických nárokov. Hlavným cieľom tejto práce je testovanie konkurencieschopnosti VmaxTMExpress ku doteraz využívanej E.coli a  optimalizácia expresie ADH1 vo VmaxTM Express, nakoľko je ADH1 využívaná  v rôznych  farmaceutických aplikáciách, pri získavaní  čistých enenatiomérnych  foriem niektorých liečiv  a taktiež  pri produkcii šesťuhlikatých vonných alkoholov pre kozmetický a farmaceutický priemysel [2].

Pri práci sme pozorovali rýchlejší rast kultúry Vmax ako E. coli. Vďaka tomu sme previedli indukciu expresie už po 1,5 h (hustota kultúry OD600 = 0,5) od preočkovania nočnej kultúry do čerstvého média, pričom u E. coli to bolo možné až po 2,5 h. Expresiu sme analyzovali pomocou  SDS-PAGE géloch. Expresia ADH1 v kmeni  VmaxTM Expres, bola efektívnejšia nakoľko percentuálne zastúpenie proteínu ADH1  voči celkovému obsahu produkovaných proteínov bolo vyššie ako v prípade E. coli. Rýchlejší nárast biomasy Vmax oproti E. coli sme potvrdili aj analýzou hmotnosti sušiny kultúry v časových intervaloch. VmaxTM Express dosahuje až dvojnásobne lepšie výsledky ako E. coli. Ďalšími krokmi v našej práci je testovanie schopnosti produkcie ADH1 v kmeni VmaxTM Express v  rôznych podmienkach ako je  zloženie média  a teplota rastu/ expresie. 

Poďakovanie: 

Poďakovanie: Príspevok je výsledkom realizácie projektov (APVV-17-0570, APVV-17-0333 a APVV-15-0466), projektu VEGA (1/0710/18), projektu „Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave“ (ITMS 26240220086) a projektu BIOREKPROT (ITMS 26240220048) na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z ERDF.

Zdroje: 

[1] Weinstock M. T., Hesek E. D., Wilson C. M., et al. (2016)Nature methods13(10), p.849.
[2] Zheng Y. G., Yi H. H., Yu D. F., et al. (2017) Appl Microbiol Biotechnol 101(3), p.987.

Diskusia

Dobrý deň,

veľmi prospešná práca. Mám otázku na expresiu ADH, a pokles po troch hodinách vo vzorke E. coli a nasledný návrat. Keďže neuvádzate ani SEM ani SD v tomto prípade môžem predpokladať, že bola zmeraná len jedna vzorka? Aká je v takom prípade relevantnosť výsledku? Nemôže isť v tomto prípade o chybu merania?

Dobrý deň,
v prípade analýzy expresie sa neuvádza SEM ani SD nakoľko expresia nebola meraná v triplikátoch tak ako sušina. V tomto prípade bola meraná iba jedna vzorka pri danej teplote kedže sa jedná iba o počiatočné štádium analýzy expresie, takže chybu pripúšťam. Keďže ďalšími krokmi je testovanie rôznych teplôt a médii, po vyhodnotení tých najoptimálnejších podmienok pre expresiu ADH, budú testovania zopakované rovnako ako aj merania.