Amyloidná agregácia proteínov je spojená s mnohými ochoreniami akými sú Alzheimerova choroba, diabetes mellitus a rôzne priónové ochorenia [1]. Molekulárnym základom týchto ochorení sú intermolekulárne interakcie nenatívnych konformérov, ktoré vedú k formovaniu amyloidných agregátov s vysokým obsahom krížovej β-štruktúry [2, 3].
V našej práci sme sa zamerali na štúdium vplyvu Lz - peptidov, krátkych fragmentov ľudského lyzozýmu na amyloidnú agregáciu lyzozýmu. Aminokyselinová sekvencia Lz-peptidov odpovedala amyloidogénnej sekvencii lyzozýmu R107-R115 (Lz peptid) alebo bola modifikovaná zvýšením kladného náboja nahradením Ala2Lys (LzK peptid). Ďalšou modifikáciou Ala5Trp došlo v peptide LzKW okrem zvýšenia náboja, aj k zvýšeniu hydrofobicity. Našim cieľom bolo zistiť, či zmena náboja a/alebo hydrofobicity aminokyselinového reťazca má vplyv na anti-amyloidné vlastnosti Lz-peptidov. Použili sme nato rôzne spektroskopické techniky (viazanie tioflavínu T (ThT) a kruhový dichroizmus (CD)) a atómovú silovú mikroskopiu (AFM).
Výsledky získané pomocou ThT metódy ukazujú, že Lz-peptidy v študovanom koncentračnom rozsahu (10 pM - 1 mM) ovplyvňujú fibrilizáciu ľudského lyzozýmu (10 μM). V prípade Lz a LzK peptidu sme pozorovali postupné znižovanie hodnôt fluorescencie ThT s rastúcou koncentráciou peptidov. Pre koncentrácie vyššie ako 100 nM sme pozorovali pokles fluorescencie k hodnotám 60% (Lz peptid), resp. 50% (LzK peptid) oproti hodnotám detegovaným pre lyzozýmové fibrily samotné (100%, kontrola). Prítomnosť LzKW peptidu nespôsobila výrazné zmeny v hodnotách fluorescencie ThT v celom študovanom rozsahu, čo naznačuje, že LzKW peptid nie je schopný inhibovať amyloidnú agregáciu ľudského lyzozýmu. Účinok Lz-peptidov bol pozorovaný aj pomocou kruhového dichroizmu. CD spektrum fibríl ľudského lyzozýmu (10µM) malo typické spektrum odpovedajúce vysokému obsahu β-listov s lokálnym minimom pri 222 nm. Zmeny v tvare spektier získané po fibrilizácii lyzozýmu v prítomnosti Lz a LzK-peptidov (60µM) poukazujú na nižšie množstvo β-listov a vyšší podiel α-helixov v porovnaní s lyzozýmovými fibrilami. LzKW peptid (60µM) spôsobil len minimálne zmeny spektra oproti lyzozýmovým fibrilám, čo naznačuje podobné zastúpenie prvkov sekundárnej štruktúry. Atómová silová mikroskopia potvrdila výsledky získané metódou viazania ThT. Lyzozýmové fibrily mali typickú morfológiu amyloidných fibríl (dlhé, tenké vlákna). Amyloidná fibrilizácia lyzozýmu v prítomnosti Lz alebo LzK peptidov spôsobila výraznú redukciu množstva amyloidných agregátov. Na druhej strane, v prípade LzKW peptidu sme nepozorovali redukciu ani zmeny v morfológii vznikajúcich fibríl.
Naše výsledky indikujú, že krátke fragmenty lyzozýmu majú schopnosť ovplyvniť tvorbu amyloidných agregátov lyzozýmu, pričom dôležité bolo ich aminokyselinové zloženie. Ukázalo sa, že zvýšenie náboja vo fragmente LzK nespôsobilo zmeny voči aktivite pozorovanej pre Lz peptid. Zvýšenie hydrofobicity fragmentu LzKW viedlo k podstatnému poklesu inhibičnej aktivity v podstate až na minimálnu úroveň. Získané výsledky poukazujú na to, že Lz a LzK peptidy môžu tvoriť základ pre dizajn látok s potenciálnym využitím pri liečbe amyloidných ochorení.
Táto práca bola podporená projektom VEGA 2/018/13.
[1] T. P. Knowles, M. Vendruscolo and C.M. Dobson, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 15 (6) (2014), 384-96.
[2] C. Haass, D.J. Selkoe, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2) (2007), 101-12.
[3] R. S. Harrison, P. C. Sharpe, Y. Singh, D.P. Fairlie, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 159 (2007), 1-77.
Model
Dobrý deň, ďakujeme za zaujímavý príspevok do sekcie. Mám na Vás niekoľko otázok: Čo podmienilo výber Vášho experimentálneho modelu tvorby amyloidných fibríl a agregátov? Čím a do akej miery korešponduje takýto model s klinickými stavmi? Akým smerom pôjde Váš ďalší výskum? Metodická otázka: Čo označujú chybové úsečky v grafoch koncentračných závislostí? Pozdravujem a želám veľa úspechov. Iveta Waczulíková
Re: Model
Dobrý deň,
ďakujem pekne za Váš komentár.
Tento model tvorby amyloidných fibríl agregátov použitý v tejto práci bol zvolený z dôvodu, že ľudský lyzozým patrí k jedným z modelových proteínov, ktorý je spájaný s bodovými mutáciami a práve tieto bodové mutácie lyzozýmu spôsobujú dedičnú systémovu amyloidózu. Toto amyloidné ochorenie je spájane práve s tým, že vzniknuté amyloidné depozity sú pozorované v rôznych častiach tela (obličkách, v lymfatických uzlinách, krvných cievach, slezine a pečeni). Čo sa týka nášho ďalšieho výskumu, chceli by sme do budúcna študovať ďalšie sekvencie fragmentov ľudského lyzozýmu prípadne peptidy, pretože takéto peptidy sa javia ako dobré inhibítory amyloidnej agregácie.
Čo sa týka Vašej metodickej otázky, tak my sme pre každú koncentráciu merali 3 vzorky, pre ktoré vyšli nejaké hodnoty a tieto hodnoty sme spriemerovali a dali do grafov. To znamená, že tieto chybové úsečky predstavujú odchýlky merania.
Pekný deň prajem
K.Uličná
Re: Re: Model
Ďakujem za odpoveď. Pre budúcnosť myslite na upresnenie odchýlok v popise grafu (predpokladám, že myslíte štandardných odchýlok SD). Bez upresnenia čitateľ nevie, či sa interval viaže k variabilite samotných údajov (interpretácia v prípade SD), alebo k variabilite samotného populačného priemeru (čo by bolo v prípade "standard error of mean" SEM.
Ešte sa chcem spýtať, tie peptidy sú komerčne dostupné? Ďakujem. iwa
Re: Re: Re: Model
Ďakujem veľmi pekne za Vašu radu.
Nie nie tie peptidy nie sú komerčne dostupné, boli syntetizované na základe požiadavok výskumu.
Re: Re: Re: Re: Model
:) hm, nie lacná záležitosť. Držím palce. iwa
Thioflavin T
Pekná práca, chcela by som sa opýtať, že prečo ste si zvolili práve Thioflavín T a či ste skúsili okrem neho aj iné látky a ak áno aké výsledky ste dosiahli. Ďakujem
Re: Thioflavin T
Re: Thioflavin T
Ďakujem pekne. Viazanie Tioflavínu T patrí k základným technikám detekcie prítomnosti amyloidných fibrilárnych agregátov. Tioflavín T sa viaže do amylodiných fibríl, konkrétne do cross (krížových) β štruktúr, ktoré sú prítomné v týchto amyloidných fibrilách. Po naviazaní ThT dochádza k zabráneniu rotácie okolo C-C väzby a následne k nárastu fluorescencie. Veľkou prednosťou tejto metodiky je, že nárast fluorescencie ThT je priamo úmerný množstvu amyloidných agregátov, čo umožňuje ich kvantifikáciu. Amyloidné fibrily dokážu špecificky naviazať ThT, následkom čoho pozorujeme nárast fluorescenčnej intenzity s maximom pri vlnovej dĺžke 485nm.
Ja som okrem ThT neskúšala žiadnu ďalšiu látku, ale do budúcna by som chcela určite vyskúšať.
Pekný deň.