Podľa posledného štatisticky vyhodnocovaného roku 2020 je karcinóm prostaty (KP), po karcinóme kolorekta a pľúc, tretím najčastejšie diagnostikovaným onkologickým ochorením postihujúcim urogenitálny systém slovenských mužov. V súčasnosti, je KP predmetom mnohých štúdií, ktorých úlohou je nielen pochopiť etiológiu tohto ochorenia, ale najmä identifikovať také biomarkery, ktoré by pomohli pri detekcii agresívnejších foriem KP a správnom nastavení kuratívnej liečby pacientov. V našej štúdií sme sa zamerali na gén EpCAM (epiteliálna bunková adhezívna molekula), ktorý predstavuje jeden z potenciálnych biomarkerov a terapeutických cieľov KP. Nadmerná expresia proteínu EpCAM sa vyskytuje až u 40-60% pacientov s KP a je tiež asociovaná s agresivitou karcinómu, tvorbou metastáz, rezistenciou na liečbu, zvýšeným rizikom recidívy a zlou prognózou pre pacienta. Náš súbor tvorilo 50 pacientov s metastatickým kastračne rezistentným karcinómom prostaty (mKRKP). Z pôvodných 5 ml periférnej krvi sme odobrali ~ 2,5 ml buffycoat-u (vrstva krvi s leukocytmi), z ktorej sme izolovali gDNA. Následne sme zmerali koncentráciu DNA, čistotu nukleových kyselín v jednotlivých eluátoch (NanoDrop™2000, Qubit®3.0). K príprave NGS knižníc bolo potrebné nariedenie DNA o koncentrácii 20 ng/µl. Samotnú sekvenáciu na platforme Illumina a analýzu primárnych sekvenačných dát realizoval externý dodávateľ v Španielsku (Sistemas Genómicos). Pre každého pacienta bol vytvorený súbor VCF. Pomocou nástroja IGV sme vizuálne kontrolovali identifikované varianty v jednotlivých exónoch génu EpCAM. Klinický význam a výskyt identifikovaných variantov sme overovali cez databázy ClinVar a VarSome, a dopad jednotlivých variantov na funkciu proteínu EpCAM sme verifikovali pomocou in silico nástrojov PolyPhen-2 a SIFT. V géne EpCAM sme identifikovali 5 variantov meniacich zmysel, tzv. missense variantov. V extracelulárnej doméne (exón 1-6), ktorá začína signálnym peptidom v exóne 1, sme lokalizovali varianty p.Ala2Val a p.Thr17Lys. In silico nástroje predpovedali poškodzujúci efekt oboch týchto variantov, aj napriek ich benígnemu statusu v databázach. V exóne 3, v doméne TY (thyroglobulin type 1), ktorá je konzervovaná v mnohých proteínoch; schopná viazať a tým inhibovať určité katepsíny (cysteín proteázy), ktoré sa podieľajú na progresii karcinómu, sa nachádzali benígne varianty p.Gln89His (možný poškodzujúci efekt: PolyPhen-2) a p.Met115Thr. V exóne 5 sme identifikovali pravdepodobne benígny variant p.Ala165Thr. Našu štúdiu by sme chceli v budúcnosti doplniť o stanovenie expresie proteínu EpCAM u pacientov s KP využitím imunohistochemickej analýzy.
Táto práca bola podporená projektmi APVV-15-0181 a VEGA č. 1-0014/22.
Yang L., Wang Q., Zhao Q., Yang F., Liu T., Huang X., Yan Q. and Yang X.: Deglycosylated EpCAM regulates proliferation by enhancing autophagy of breast cancer cells via PI3K/Akt/mTOR pathway. Aging. 2021, 14(1):316-29.
Kliment J., Baluchova K., Grendár M., Eliáš B., Mráz R., Čech P., Holečková K., Kliment J. jr. and Drobková H.: Suboptimálna liečebná odpoveď u pacientov s mKRKP a prítomnosťou AR-V7 liečených abiraterónom a enzalutamidom. Klinická urológia. 2020, 16(1):6-12.
Huang L., Yang Y., Yang F., Liu S., Zhu Z., Lei Z. and Guo J.: Functions of EpCAM in physiological processes and diseases (Review). International Journal of Molecular Medicine. 2018, 42:1771-85.
Xu T., Liu Y.,. Schulga A., Konovalova E., Deyev SM., Tolmachev V. and Vorobyeva A.: Epithelial cell adhesion molecule‑targeting designed ankyrin repeat protein‑toxin fusion Ec1‑LoPE exhibits potent cytotoxic action in prostate cancer cells. Oncology Reports. 2022, 47:94-103.
Ni J., Cozzi P., Beretov J., Duan W., Bucci J., Graham P. and Li Y.: Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is involved in prostate cancer chemotherapy/radiotherapy response in vivo. BMC Cancer. 2018, 18:1092-1111.
Dobrý deň, pekná práca,
Dobrý deň, pekná práca, blahoželám k výsledkom. Pre zaujímavosť, prosím Vás, aká je aktuálna situácia v klinike, aké diagnostické nástroje majú lekari v rukách pri detegovaní KP? Vaša experimentálna práca sa snaží posunúť hranice poznania ďalej, čo je chválihodné. Vedeli by ste odhadnúť inštrumentálnu náročnosť zavedenia Vami prezentovanej metodiky identifikácie mutácií v génoch do praxe? Vopred Vám ďakujem za úvahu, ZB
Dobrý deň, ďakujem za
Dobrý deň, ďakujem za pochvalu a za váš komentár. K základným vyšetreniam prostaty patrí vyšetrenie krvi, predovšetkým je zaujímavá hladina PSA (prostatického špecifického antigénu), kedy však nemusí vždy zvýšená hodnota nevyhnutne znamenať karcinóm prostaty, pretože táto hladina PSA býva sprievodným javom benígnej hyperplázie prostaty (BHP) alebo rôznych zápalov. Robí sa tiež palpačné vyšetrenie cez konečník, aby sa zistilo, či sa prostata nezväčšuje. Môže to tiež znamenať BHP. Preto, ak sa lekárovi nezdajú výsledky PSA a veľkosť prostaty, ďalej pacient podstúpi transrektálnu biopsiu prostaty, počas ktorej je pacientovi odobratá vzorka tkaniva prostaty na histologické vyšetrenie. Podľa nálezu potom lekár navrhne požadovanú liečbu. Tu je ten háčik. Zväčša liečba zaberá a výsledky sú skvelé, avšak väčšina pacientov si vytvorí rezistenciu. Preto vidíme dôležitosť vo vyšetrovaní molekulárnych aspektov tohto ochorenia, pretože sa líši svojim priebehom, aj agresiou a aj prežívanie pacientov je rôzne. Donedávna sa robila aj izolácia CTC buniek, kde sme vedeli určiť prítomnosť AR-V7 variantu, ktorého prítomnosť koreluje s odpoveďou pacienta na danú liečbu. Takým pacientom bola potom liečba zmenená. Ich prežívanie bolo signifikantne dlhšie. Avšak, týchto biomarkerov je omnoho viac. A táto téma je naozaj rozsiahla, až by som povedala že nemá konca. Všetky tieto metodiky, či už stanovovanie CTC buniek, alebo sekvenovanie sú finančne veľmi náročné. Na genetické testovanie majú nárok pacienti s rodinnou anamnézou, avšak nie všetci pacienti s vrodenými mutáciami a predispozíciou na toto ochorenie majú v rodine KP. Je tiež ťažké aj vybrať gény, ktoré sekvenovať, pretože nie je žiadna príručka, ktorá by nám povedala že áno, bol to BRCA1 alebo PTEN, EPCAM a rôzne iné. My sme v našom projekte sekvenovali z krvi, či naši pacienti nemali vrodené mutácie v 111 génoch, ktoré súvisia s karcinogenézou, čo naše výsledky vyvrátili. Bolo by teda potrebné pozrieť sa na tie somatické mutácie, čiže sekvenovať z DNA tkaniva prostaty.
Dúfam, že som zodpovedala vaše otázky :) ďakujem ešte raz. KHH
Dobrý deň, ďakujem za
Dobrý deň, ďakujem za promptnú, obsažnú a precíznu odpoveď. Veľa úspechov do Vašej ďaľšej práce želá ZB.
Ďakujem :)
Ďakujem :)