Peroxidázy sa všeobecne klasifikujú do skupiny oxidoreduktáz. Sú druhou najväčšou enzýmovou triedou používanou v biotechnologických aplikáciach. Tieto enzýmy sa používajú na katalýzu rôznych oxidačných reakcií s použitím peroxidu vodíka a iných substrátov, ako donorov elektrónov. Peroxidázové enzýmy sú využiteľné v mnohých oblastiach od bioenergetiky až po bioremediácie. Funkcia peroxidáz závisí aj od ich pôvodu alebo zdroja [1]. Ektomykorízne huby sú potenciálnym rezervoárom peroxidázových génov. Napríklad genóm Cortinarius glaucopus kóduje 11 peroxidáz, pričom tento počet je porovnateľný s mnohými drevokaznými hubami [2]. Niektoré druhy húb sa prednostne vyskytujú v lesoch s vysokým stupňom prirodzenosti [3]. Badínsky prales zahŕňa pralesovité klimaxové lesné spoločenstvá bukového vegetačného stupňa, kde sú zastúpené všetky tri základné vývojové štádia pralesov na územi Európy. V národnej prírodnej rezervácii Badínsky prales je podmienený výskyt špecifickej mykoflóry, typickej pre špecifické ekologické a klimatické podmienky karpátskych pralesov [4]. Hlavným cieľom tejto práce bolo amplifikovať gény kódujúce peroxidázy z ektomykoríznych húb a stanoviť primárnu štruktúru týchto génov. V tejto práci sme sa najskôr venovali izolácii metagenómu z pôdnych vzoriek, ktoré pochádzali z rôznych časti Badínského pralesa. Rovnako sme izolovali genómy z hubových plodníc, ktoré pochádzali z pohoria Vtáčnik a z mesta Bratislava. Následne sme prevádzali PCR amplifikáciu peroxidázových génov, respektíve ich častí, kedy boli ako templáty použité izolované genómy a metagenómy. V týchto reakciách boli použité primery série SlutHTP4c navrhnuté voči začiatku a koncu známeho peroxidázového génu SlutHTP4 pre fungálny druh Suillus luteus. Rovnako sme prevádzali PCR amplifikáciu so SlutHTP4a primermi, navrhnutými voči úsekom v konzervovanej oblasti katalytického jadra tejto peroxidázy, ktorých výsledkom boli kratšie úseky génov. Získali sme PCR produkty, pomocou ktorých sme po vytvorení genómových knižníc a ich následnom Sangerovom sekvenovaní, vedeli k danej sekvencii priradiť peroxidázu z konkrétneho fungálneho druhu s najvyššou identitou. Na tento účel sme použili online databázy blastX (NCBI) a Uniprot. Použitím primerov SlutHTP4a sa nám doteraz podarilo zachytiť a identifikovať 8 konzervovaných úsekov peroxidázových génov zo vzoriek z Badínského pralesa a 1 takýto úsek zo vzorky z mesta Bratislava. Kompletný peroxidázový gén sme zachytili pomocou primerov SlutHTP4c z hubovej plodnice pochádzajúcej z pohoria Vtáčnik. Ide o gén s veľkosťou 812 nukleotidov, ktorý v databázach vykazoval najvyššiu podobnosť s chlóroperoxidázou z ektomykoríznej huby Suillus occidentalis (KAG1761790.1), pričom sa s touto sekvenciou zhoduje na 89 %.
Our research was supported by the Slovak Grant Agency with project VEGA 2/0012/22 and by the Slovak Research and Development Agency with project APVV-20-0284.
[1] Twala, P. P., Mitema, A., Baburam, C., & Feto, N. A. (2020). Breakthroughs in the discovery and use of different peroxidase isoforms of microbial origin. AIMS microbiology, 6(3), 330.
[2] Bödeker, I. T., Clemmensen, K. E., de Boer, W., Martin, F., Olson, Å., Lindahl, B. D. (2014). Ectomycorrhizal C ortinarius species participate in enzymatic oxidation of humus in northern forest ecosystems. New Phytologist, 203(1), 245-256.
[3] Kunca, V., Peiger, M., Tomka, P., Vampola, P. (2022). Old-growth forest fungi--new localities and habitat and host preferences in Slovakia (I). Czech Mycology, 74(1).
[4] Mihál, I. (2013). K poznaniu mykoflóry (Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota–Fungi imperfecti) Národnej prírodnej rezervácie Badínsky prales. Natura Carpatica, 54, 7-16.
Dobrý deň, zaujala ma Vaša
Dobrý deň, zaujala ma Vaša práca, bohužiaľ, prezentácia nie je dostupná. V abstrakte sumarizujete, že sa Vám podarilo zachytiť a identifikovať 8 konzervovaných úsekov peroxidázových génov zo vzoriek z Badínského pralesa a 1 takýto úsek zo vzorky z mesta Bratislava. Mňa by zaujímalo, ako ďalej naložíte s týmto poznatkom... V úvode spomínte značný aplikačný potenciál peroxidázových enzýmov v biotechnológii, a teda by som chcela vedieť, kde a ako konkrétne by ste vedeli využiť Vami identifikované gény. Vopred ďakujem za úvahu, ZB
Dobrý deň, pani doktorka,
Dobrý deň, pani doktorka,
ospravedlňujem sa za neskoršiu odpoveď, len zrejme mi neprišlo upozornenie na Vašu otázku. Všimol som si ju až teraz náhodou. K Vašej otázke by som odpovedal následovne: V prvom rade sa budeme pokúšať získať kompletné sekvencie viacerých peroxidáz (niektoré máme k dispozícii už teraz, dokonca sme už niećo posielali do GeneBanku). Následne budeme tieto peroxidázy zaraďovať do databáz. To bude mať význam z hľadiska distribúcie peroxidáz v skúmaných organizmoch, z hľadiska výskumu ich evolúcie a samozrejme sa takto zaradia nové, doteraz neznáme peroxidázy, k známym peroxidázam. Využitie týchto nových peroxidáz predpokladáme za účelom sanácii v zelenej biotechnológii. Rovnako by mohli byť použité ako biologicky rozpoznávací prvok pri biosenzoroch. Avšak najskôr bude potrebné stanoviť ich aktivitu pri rôznych podmienkach a rovnako zistiť ich špecifické substráty, ktoré by boli vhodné pre tieto peroxidázy. Bohuš Kubala
Zdravím, ďakujem veľmi pekne
Zdravím, ďakujem veľmi pekne za odpoveď, potvrdzujem príjem informácií. Želám Vám všetko dobré do ďalšej experimentálnej práce. Srdečne, ZB