Úvod:
Diazoxid (DZX) je často používaný na indukciu farmakologického preconditioningu myokardu v animálnych modeloch. Táto zlúčenina bola pôvodne označovaná ako otvárač mitochondriových od ATP závislých draslíkových kanálov (KATP). I napriek jeho viac preskúmaným, prevažne negatívnym účinkom akými sú: inhibícia Krebsovho cyklu na úrovni sukcinátdehydrogenázy, podpora tvorby voľných radikálov a jeho prvoradé pôsobenie na aktiváciu PKC-ε ako na otváranie KATP- kanálov, ostáva otázka molekulárneho mechanizmu kardioprotektívneho účinku DZX naďalej málo objasnená. V ďalších štúdiach bol však potvrdený protektívny vplyv akútneho streptozotocínového diabetu na myokard vplyvom zvýšenej aktivity Mg2+-ATPázy, ktorá s týmto procesom úzko súvisí. Cieľom štúdie bolo objasniť úlohu mitochondriovej Mg2+-ATPázy a membánovej fluidity v mechanizme účinku DZX a priblížiť tak využitelnosť farmakologického preconditioningu v praxi.
Metódy:
Experimenty boli vykonané na 9-11 týždňových potkanoch samcov kmeňa Wistar rozdelených na kontrolnú zdravú (n=16) a diabetickú (n=16) skupinu. Akútny (8-dňový) diabetes bol indukovaný jednorazovou dávkou streptozotocínu (65 mg.kg-1, i.p.). Srdcové mitochondrie izolované diferenciálnou centrifugáciou boli vystavené účinku DZX (0-7 μmol.l-1). Aktivita mitochondriovej ATPsyntázy, stanovená v obrátenom smere jej reakcie, (Mg2+-ATPáza) ako množstvo Pi uvoneľného pri štiepení ATP. Fluidita lipidovej dvojvrstvy mitochondriovej membrány bola stanovená meraním fluorescenčnej anizotropie fluorescenčnou sondou 1,6- difenyl-1,3,5-hexatriénu.
Výsledky:
Aktivita mitochondriovej Mg2+-ATPázy sa počnúc koncentráciou 3,5 μmol.l-1 DZX postupne zvyšovala a to v oboch experimentálnych skupinách, pričom štatistická významnosť (p<0,05) bola dosiahnutá len v skupine kontrolných zvierat v prítomnosti DZX 5; 6 a 7 μmol.l-1. Stimulácia enzýmovej aktivity nebola sprevádzaná významným (p˃0,05) zvýšením membránovej fluidity mitochondrií ani v jednej z experimentálnych skupín.
Záver:
Pozitívny účinok DZX sa neprejavil v plnej miere, nakoľko v diabetických srdciach bola Mg2+-ATPázová aktivita aj fluidita vystimulovaná už pôsobením samotného diabetu. I napriek tomu vplyv akútneho diabetu a farmakologického DZX indukovaného preconditioningu mal aditívny účinok. Kinetické parametre ukazujú, že DZX priamo interaguje s molekulou mitochondriovej Mg2+-ATPázy a to spôsobom nekompetetívnej aktivácie.
Granty: VEGA 2/0101/12, 2/0054/11, 2/027/11, KEGA 003 UK-4/2012.
efekt ucinku
Ahoj Magdi:) vies mi prosim napisat ktory z pozorovanych ucinkov bol markantnejsi? Pises, ze vplyv dzx mal na diabeticku skupinu aditivny efekt.. aky bol efekt ucinku samostatneho dzx oproti samostatnemu ucinku diabetu? Bol prejav oboch ovplyvneni rovnaky, alebo si pozorovala pri diabetickom modeli vyraznejsi ucinok? Este by ma zaujimalo, nakolko poznam prejav akutneho diabetu v ramci endogennych ochrannych mechanizmov a adaptacie... je mozne z tvojich vysledkov urcit koncentraciu dzx, ktora by ucinne a do maximalne moznej miery vystimulovala pozitivny ucinok samotneho diabetu? Samozrejme stale mam na mysli experimentalny akutny model diabetu.. dakujem krasne za odpovede a tesim sa na pokracovanie v spolocnej studii v danej problematike... prajem vsetko dobreee
Re: efekt ucinku
Ahoj Mirko,
z vysledkov nasho experimentu vyplyva, ze ucinok diabetu a DZX je priblizne rovnaky. Diabetes sposobil 18,72%-ne zvysenie aktivity mitochondriovej Mg2+-ATPazy a pritomnost 7 µmol DZX (najvyssia pouzita koncentracia) 16,70%-ny narast aktivity enzymu v porovnani s kontrolami.
V pripade kombinacie akutneho diabetu so 7 µmol DZX doslo k zvyseniu aktivity enzymu az o 29,06% oproti kontrolam. Ucinok DZX s diabetom ma teda aditivny chatrakter i ked DZX nedokaze vystimulovat aktivitu Mg2+-ATPazy mitochondrii z diabetickych srdc v plnej miere, nakolko ta je uz vystimulovana ucinkom diabetu.
Zvysovanim koncentracie DZX by doslo aj k postupnemu zvyseniu pozitivnych ucinkov akutneho diabetu. Na dosiahnutie maximalneho pozitivneho efektu akutneho diabetu, by bolo nutne zvysit koncentraciu DZX na vhodne optimum, ktore este dokaze pozitivne ucinky akutneho diabetu stimulovat ale neposobi na mitochondrie toxicky.
Re: Re: efekt ucinku
Magdi, dakujem krasne za odpoved :)
otázka
Dobrý deň Magda! V prvom rade Vám gratulujem k peknej práci! Chcela by som sa opýtať konkrétne na EOM. Neviem totiž, či som prácu dobre pochopila. :) Uvádzate, že pozitívny účinok DZX sa v diabetických srdciach neprejavil v plnej miere, nakoľko bola Mg2+ ATPázová aktivita aj fluidita vystimulovaná už pôsobením samotného diabetu. Ale to by muselo znamenať, že budú prítomné zmeny vo fluidite membrán u diabetických potkanov vs. kontroly. Ak však porovnám obr. 6 (DZX0 - DIA) a obr. 5 (DZX0 - Kontr)tak nezbadám výrazné zmeny. Ale v tejto oblasti sa nevyznám, tak prosím Vás o vysvetlenie. Ďakujem.
Re: otázka
Dobry den,
dakujem za kladne ohodnotenie a zaroven za dobru pripomienku. Vo vsetkych predchadzajucich studiach bol efekt EOM vyvolany akutnym diabetom pozorovany ako na zvysenej aktivite mitochondriovej Mg2+-ATPazy tak aj na zvysenej fluidite mitochondriových membrán (Ferko a kol., 2006; Ziegelhöffer a kol., 2012). V predlozenej praci sme vsak zvysenie fluidity mitochondriovych membran z akutne diabetickych srdc v porovnani s kontrolami nezaznamenali. S ohladom na predchadzajuce vysledky predpokladame, ze v uvedenej praci doslo k vyraznemu prejavu individualnej variability z dovodu nizkeho poctu merani.
Re: Re: otázka
Magda! Ďakujem pekne! Držím Vám palce! :)
Ahoj Magdi
Veľmi pekná prezentácia:) Píšeš, že v srdcových mitochondriách diabetických potkanov došlo mala aplikácia STZ (farmakologického preconditioningu)sa pozitívny účinok neprejavil v plnej miere, zrejme vďaka ich synergickému pôsobeniu. Čo si myslíš aké môže byť prepojenie vplyvu diabetu a farmakologického preconditioningu v srdcových mitochondriách, prípadne kardiomyocytoch na molekulárnej urovni? Sú o tom v literatúre vôbec nejaké údaje? Ďakujem
Re: Ahoj Magdi
Ahoj Slavka,
dakujem :) ... mechanizmus farmakologickeho preconditioningu sme riesili na enzymatickej urovni. Zistili sme, ze ide o priamu interakciu DZX s mitochondriovou Mg2+-ATPazou. DZX sa viaze na ine ako aktivne miesto enzymu a stimuluje tak jeho aktivitu mitochondriovej Mg2+-ATPazy, t.j. ide o nekompetitivnu aktivaciu mitochondriovej Mg2+-ATPazy. DZX nema vyznamny vplyv na fluiditu mitochondrii.
Po navodeni stavu zataze - akutneho diabetu, pritomnost DZX napomaha vylepsit patologicke podmienky a zvysit produkciu energie na najvyssi mozny stupen. Opat teda dochadza k zvyseniu aktivity mitochondriovej Mg2+-ATPazy, co je v pripade akutneho diabetu podporene aj zvysenou fluiditou mitochondriovej membrany v dosledku tvorby mPTP (mitochondriovych transportnych porov), ktora umoznuje zlepsenie pohyblivosti enzymu v membrane.
Tuto problematiku sme neriesili na molekularnej urovni avsak ako uvadza literatura, DZX je inhibitor Krebsovho cyklu na urovni sukcinatdehydrogenazy, cim sa navodi situacia podobna pseudohypoxii, ktora nastava pri diabete. DZX je taktiez je otvarac KATP-kanalov v mitochondriach, ktorym sa priklada vyznam v ulohe kardioprotekcie. Predpoklada sa vsak, ze mitochondriove KATP-kanaly nie su konecnym efektorom a do procesu preconditioningu mozu byt zapojene aj dalsie podjednotky ako PKCɛ, PPARδ a p38MAPK.