Mila Barborka,
velmi ma zaujal tvoj prispevok.
Chcela by som sa spytat aky je fyziologicky prejav zvysenej aktivity Na+/K+-ATPazy na funkciu mozgovej kôry u diabetickych potkanov.
Z literatúry vieme, že pri diabete mellitus vzniká hyperglykémia, ktorá môže vyvolať poškodenie mozgu. Hyperglykémia môže spôsobiť acidózu a dehydratáciu, oba javy zapojené do ......zníženia prekrvenia mozgu a vzniku ischémie. Hyperglykémia má akútne, ako aj chronické účinky na bunkové funkcie v mnohých tkanivách a môže mať vplyv aj na aktivitu Na,K-ATPázy a transmembránovú signalizáciu.
Zmena v aktivite enzýmu u diabetických zvierat pravdepodobne odráža kratšie trvanie hyperglykemických podmienok, kedy sa bunky v nami sledovanom tkanive ešte snažia zachovať homeostázu Na+ pomocou zvýšenej aktivity Na,K-ATPázy. Táto reakcia je akousi adaptívnou zmenou, pretože pri dlhodobej hyperglykémii sa aktivita sodíkovo-draslíkovej pumpy znižuje. Taktiež Wald a kol. (1986) opísali zvýšenú aktivitu Na,K-ATPázy v proximálnom kanáliku potkanov 24h-8dní po indukovaní STZ-diabetu. Tento účinok pripisovali zvýšenej absorpcii glukózy v dôsledku zvýšenej aktivity glukózových transportérov. Príjem glukózy cez hematoencefalickú bariéru je tiež sprostredkovaný Na,K-ATPázou, pretože tá je zodpovedná za vytvorenie a udržiavanie Na+ gradientu potrebného pre činnosť Na+/glukózového kotransportéru (You-Gui Li a kol., 2013).
Ahoj,
na nasom pracovisku sa robia studie aj na oblickach a na srdci. Vysli nam zaujimave vysledky, preto sme sa rozhodli rozsirit experimenty aj na mozog (mozgova kora, mozocek, predlzena miecha).
Ďakujem za otázku, Erik :)
Nad sledovaním aktivity NKA po podaní inzulínu sme zatiaľ neuvažovali. Z literatúry a z mnohých experimentálnych prác je nám známe, že potkanom, ktorým bol vyv...olaný diabetes streptozotocínom, klesá množstvo molekúl Na+,K+-ATPázy v bunkovej membráne. Avšak u potkanov, ktorí boli následne liečení inzulínom, koncentrácia tohto enzýmu vzrastá (Schmidt a kol., 1994). Inzulín zvyšuje aktivitu Na+,K+-ATPázy zvýšením afinity sodíkovej pumpy ku Na+ (Vague a kol., 2004) alebo taktiež translokáciou jednotlivých podjednotiek Na+,K+-ATPázy (α a β) z intracelulárnej zásoby do plazmatickej membrány (Lavoie a kol., 1996).
Dobrý deň Barbora! Chcela by som sa Vás opýtať, že po akej dlhej dobe sa vyvinie DM u potkanov po podaní STZ? Píšete, že "8 dní trvajúci DM", to znamená, že potkany majú hneď nasledujúci deň po podaní STZ hyperglykémiu? Ešte by som sa Vás chcela opýtať, že aký je mechanizmus, resp. ako dochádza k zvýšeniu aktivity Na/K-ATPázy (resp. k zlepšeniu väzbových vlastností enzýmu pre sodík) u diabetických potkanov? Ďakujem!
Ďakujem za otázku, Angelika :)
V súčasnosti je najpoužívanejší model diabetu navodený streptozotocínom (STZ), ktorý poškodzuje beta bunky pankreasu u ľudí aj zvierat. Napodobňuje ľudský model diabetu mellitus závislého na inzulíne. STZ je analógom glukózy a preto je v organizme vychytávaný glukózovým transportérom typu GLUT-2, ktorý sa exprimuje práve v β-bukách pankreasu. STZ je schopný v dávke 60 mg∙kg-1 vyvolať u potkana diabetes do 2-4 dní (Akbarzadeh a kol., 2007). Toto akútne štádium diabetu je vhodným modelom pre štúdium akútnej hyperglykemickej krízy bez sekundárnych komplikácií, ktoré sprevádzajú chronický diabetes a nie sú v tomto období ešte rozvinuté.
Predchádzajúce experimentálne štúdie diabetu melitus typ 1 (DM1) (s dĺžkou trvania od 2 dní do 2 týždňov) ukázali zvýšenie aktivity Na+,K+-ATPázy počas patologických stavov v rôznych tkanivách, napr. v mozgovej kôre, v predĺženej mieche (Ahmed a Zahra, 2011), v obličke (Tsimaratos, 2001, Javorková a kol., 2009) alebo v tenkom čreve (Barada a kol., 1994). Toto počiatočné zvýšenie aktivity enzýmu naznačuje na adaptáciu enzýmu v dôsledku krátkodobého diabetu - v našej práci sme ju pozorovali ako zlepšenie afinity voči sodíku. Kratkodobý DM1 pravdepodobne vyvolal zmeny v štruktúre enzýmu v oblasti Na-väzbového miesta, čo spôsobilo zlepšenú schopnosť enzýmu viazať tento kofaktor, ako na to naznačujú znížené hodnoty Km pre Na+ u diabetických samcov v porovnaní s kontrolami. Pri krátkodobom diabete môže byť jedným z dôvodov zmeny aktivity sodíkovo-draslíkovej pumpy fosforylácia katalytickej alfa podjednotky enzýmu. Takýmto regulátorom môže byť aj malý membránovo viazaný proteín, ktorý je v mozgu označovaný ako FXYD7 (Geering, 2005). Tento proteín býva asociovaný s alfa podjednotkou Na+,K+-ATPázy je substrátom pre proteínkinázy A a C (Wang a kol., 2006).
Ďakujem za otázku, Katarína :)
Plazmatické membrány z kôry mozgu potkanov sme izolovali podľa metódy Jorgensena (1974). Následne sme stanovili obsah vyizolovaných bielkovín podľa Lowryho metódy (1951) a kinetické merania sme určili v závislosti od vzrastajúcej koncentrácie substrátu enzýmu - ATP (0,16 - 8 mmol.l-1), alebo od vzrastajúcej koncentrácie kofaktoru Na+ (2 - 100 mmol.l-1). Množstvo uvoľneného anorganického fosfátu počas hydrolýzy ATP sme merali spektrofotometricky podľa Tausskeho a Shorra (1953).
Kinetické parametre sme vyhodnocovali nelineárnou regresiou získaných údajov (Sigma plot) a metódou ANOVA.
Ahoj Borka:) Veľmi pekná a hodnotná práca!!! Je všeobecne známe, že Na,K-ATPáza predstavuje systém, ktorý sa zúčastňuje na udržiavaní membránového potenciálu tým, že udržiava rovnováhu sodíka a tiež je zodpovedná za aktívny transport nadbytočného Na von z bunky. Ja by som mala na teba len jednu otázočku. Mňa by však zaujímalo, či by dokázala fungovať aj len ako polovičná ATPáza. Teda, či sa dá vystimulovať len jedným iónom, či už sodíkom alebo draslíkom. Ďakujem za odpoveď :)
Ahoj Martinka!
Na+,K+-ATPáza je enzýmový systém, ktorý je aktivovaný kombinovaným účinkom iónov Na+ na intracelulárnej strane membrány a iónov K+ na extracelulárnej strane membrány. Na+-pumpa využíva energiu získanú z hydrolýzy ATP na výmenu 3 iónov Na+ z bunky za 2 ióny K+ z vonkajšieho prostredia na zachovanie transmembránového Na+ gradientu. Čize plati pomer 2 K+ dnu a 3 Na+ von, čo vytvára v bunke zaporný potenciál, a preto sa považuje za elektrogénnu pumpu. Čize, Na,K-ATPáza nefunguje ako polovicna ATPáza :)
Ale... v literatúre spomína, že v bazolaterálnej membráne proximálnych tubulov obličiek sa okrem ouabaín senzitívnej Na,K-ATPázy nachádza aj Na+-ATPáza, ktorá je ouabaín-rezistentná, citlivá na furosemid a je aktivovaná len iónmi Na+ (Caruso-Neves a kol., 2000).
Okrem toho sú známe aj iné typy ATPáz. Zatiaľ čo Na,K-ATPáza je P-typ ATPázy, ktorá je závislá na koncentrácii iónov Na+ aj K+, existuje aj Na+-ATPáza nezávislá od koncentrácie iónov K+. Ide buď o V-typ ATPázy (lokalizovaná na membráne vakuoly) - napr. u Enterococcus Hirai (Murata a kol., 2005) alebo o F-typ ATPázy (lokalizovaná v bakteriálnych membránach)- napr. u Ilyobacter tartaricus (Meier a kol., 2005).
Dakujem za otazku a prajem prijemny zvysok weekendu :)
Mila Barborka, velmi ma zaujal tvoj prispevok. Chcela by som sa
Mila Barborka,
velmi ma zaujal tvoj prispevok.
Chcela by som sa spytat aky je fyziologicky prejav zvysenej aktivity Na+/K+-ATPazy na funkciu mozgovej kôry u diabetickych potkanov.
Re: Mila Barborka, velmi ma zaujal tvoj prispevok. Chcela by som
Ahoj Lucka!
Z literatúry vieme, že pri diabete mellitus vzniká hyperglykémia, ktorá môže vyvolať poškodenie mozgu. Hyperglykémia môže spôsobiť acidózu a dehydratáciu, oba javy zapojené do ......zníženia prekrvenia mozgu a vzniku ischémie. Hyperglykémia má akútne, ako aj chronické účinky na bunkové funkcie v mnohých tkanivách a môže mať vplyv aj na aktivitu Na,K-ATPázy a transmembránovú signalizáciu.
Zmena v aktivite enzýmu u diabetických zvierat pravdepodobne odráža kratšie trvanie hyperglykemických podmienok, kedy sa bunky v nami sledovanom tkanive ešte snažia zachovať homeostázu Na+ pomocou zvýšenej aktivity Na,K-ATPázy. Táto reakcia je akousi adaptívnou zmenou, pretože pri dlhodobej hyperglykémii sa aktivita sodíkovo-draslíkovej pumpy znižuje. Taktiež Wald a kol. (1986) opísali zvýšenú aktivitu Na,K-ATPázy v proximálnom kanáliku potkanov 24h-8dní po indukovaní STZ-diabetu. Tento účinok pripisovali zvýšenej absorpcii glukózy v dôsledku zvýšenej aktivity glukózových transportérov. Príjem glukózy cez hematoencefalickú bariéru je tiež sprostredkovaný Na,K-ATPázou, pretože tá je zodpovedná za vytvorenie a udržiavanie Na+ gradientu potrebného pre činnosť Na+/glukózového kotransportéru (You-Gui Li a kol., 2013).
mozog
Dobrý den, zaujimalo by ma, preco ste sa rozhodli studovat práve NaKATPazu v mozgu? Co ine tkaniva? Dakujem
Re: mozog
Ahoj,
na nasom pracovisku sa robia studie aj na oblickach a na srdci. Vysli nam zaujimave vysledky, preto sme sa rozhodli rozsirit experimenty aj na mozog (mozgova kora, mozocek, predlzena miecha).
mozog
Dobrý den, zaujimalo by ma, preco ste sa rozhodli studovat práve NaKATPazu v mozgu? Co ine tkaniva? Dakujem
otazka
Dobrý deň, ja by som sa rád opýtal, či ste uvažovali aj nad sledovaním aktivity Na+/K+ ATPáz u diabetických potkanov po podaní inzulínu? ďakujem
Re: otazka
Ďakujem za otázku, Erik :)
Nad sledovaním aktivity NKA po podaní inzulínu sme zatiaľ neuvažovali. Z literatúry a z mnohých experimentálnych prác je nám známe, že potkanom, ktorým bol vyv...olaný diabetes streptozotocínom, klesá množstvo molekúl Na+,K+-ATPázy v bunkovej membráne. Avšak u potkanov, ktorí boli následne liečení inzulínom, koncentrácia tohto enzýmu vzrastá (Schmidt a kol., 1994). Inzulín zvyšuje aktivitu Na+,K+-ATPázy zvýšením afinity sodíkovej pumpy ku Na+ (Vague a kol., 2004) alebo taktiež translokáciou jednotlivých podjednotiek Na+,K+-ATPázy (α a β) z intracelulárnej zásoby do plazmatickej membrány (Lavoie a kol., 1996).
otázky
Dobrý deň Barbora! Chcela by som sa Vás opýtať, že po akej dlhej dobe sa vyvinie DM u potkanov po podaní STZ? Píšete, že "8 dní trvajúci DM", to znamená, že potkany majú hneď nasledujúci deň po podaní STZ hyperglykémiu? Ešte by som sa Vás chcela opýtať, že aký je mechanizmus, resp. ako dochádza k zvýšeniu aktivity Na/K-ATPázy (resp. k zlepšeniu väzbových vlastností enzýmu pre sodík) u diabetických potkanov? Ďakujem!
Re: otázky
Ďakujem za otázku, Angelika :)
V súčasnosti je najpoužívanejší model diabetu navodený streptozotocínom (STZ), ktorý poškodzuje beta bunky pankreasu u ľudí aj zvierat. Napodobňuje ľudský model diabetu mellitus závislého na inzulíne. STZ je analógom glukózy a preto je v organizme vychytávaný glukózovým transportérom typu GLUT-2, ktorý sa exprimuje práve v β-bukách pankreasu. STZ je schopný v dávke 60 mg∙kg-1 vyvolať u potkana diabetes do 2-4 dní (Akbarzadeh a kol., 2007). Toto akútne štádium diabetu je vhodným modelom pre štúdium akútnej hyperglykemickej krízy bez sekundárnych komplikácií, ktoré sprevádzajú chronický diabetes a nie sú v tomto období ešte rozvinuté.
Predchádzajúce experimentálne štúdie diabetu melitus typ 1 (DM1) (s dĺžkou trvania od 2 dní do 2 týždňov) ukázali zvýšenie aktivity Na+,K+-ATPázy počas patologických stavov v rôznych tkanivách, napr. v mozgovej kôre, v predĺženej mieche (Ahmed a Zahra, 2011), v obličke (Tsimaratos, 2001, Javorková a kol., 2009) alebo v tenkom čreve (Barada a kol., 1994). Toto počiatočné zvýšenie aktivity enzýmu naznačuje na adaptáciu enzýmu v dôsledku krátkodobého diabetu - v našej práci sme ju pozorovali ako zlepšenie afinity voči sodíku. Kratkodobý DM1 pravdepodobne vyvolal zmeny v štruktúre enzýmu v oblasti Na-väzbového miesta, čo spôsobilo zlepšenú schopnosť enzýmu viazať tento kofaktor, ako na to naznačujú znížené hodnoty Km pre Na+ u diabetických samcov v porovnaní s kontrolami. Pri krátkodobom diabete môže byť jedným z dôvodov zmeny aktivity sodíkovo-draslíkovej pumpy fosforylácia katalytickej alfa podjednotky enzýmu. Takýmto regulátorom môže byť aj malý membránovo viazaný proteín, ktorý je v mozgu označovaný ako FXYD7 (Geering, 2005). Tento proteín býva asociovaný s alfa podjednotkou Na+,K+-ATPázy je substrátom pre proteínkinázy A a C (Wang a kol., 2006).
Re: Re: otázky
Barbora ďakujem pekne! :)
Metóda stanovenia
Dobrý deň, chcela by som sa opýtať, akú metódu merania ste použili resp. na zistenie kinetických parametrov ste použili nejaký program?
Ďakujem.
Re: Metóda stanovenia
Ďakujem za otázku, Katarína :)
Plazmatické membrány z kôry mozgu potkanov sme izolovali podľa metódy Jorgensena (1974). Následne sme stanovili obsah vyizolovaných bielkovín podľa Lowryho metódy (1951) a kinetické merania sme určili v závislosti od vzrastajúcej koncentrácie substrátu enzýmu - ATP (0,16 - 8 mmol.l-1), alebo od vzrastajúcej koncentrácie kofaktoru Na+ (2 - 100 mmol.l-1). Množstvo uvoľneného anorganického fosfátu počas hydrolýzy ATP sme merali spektrofotometricky podľa Tausskeho a Shorra (1953).
Kinetické parametre sme vyhodnocovali nelineárnou regresiou získaných údajov (Sigma plot) a metódou ANOVA.
Re: Re: Metóda stanovenia
Dakujem za podrobnu odpoved. Prajem vela uspechov.
Re: Re: Re: Metóda stanovenia
Ďakujem :) nápodobne :)
Na,K-ATPáza
Ahoj Borka:) Veľmi pekná a hodnotná práca!!! Je všeobecne známe, že Na,K-ATPáza predstavuje systém, ktorý sa zúčastňuje na udržiavaní membránového potenciálu tým, že udržiava rovnováhu sodíka a tiež je zodpovedná za aktívny transport nadbytočného Na von z bunky. Ja by som mala na teba len jednu otázočku. Mňa by však zaujímalo, či by dokázala fungovať aj len ako polovičná ATPáza. Teda, či sa dá vystimulovať len jedným iónom, či už sodíkom alebo draslíkom. Ďakujem za odpoveď :)
Re: Na,K-ATPáza
Ahoj Martinka!
Na+,K+-ATPáza je enzýmový systém, ktorý je aktivovaný kombinovaným účinkom iónov Na+ na intracelulárnej strane membrány a iónov K+ na extracelulárnej strane membrány. Na+-pumpa využíva energiu získanú z hydrolýzy ATP na výmenu 3 iónov Na+ z bunky za 2 ióny K+ z vonkajšieho prostredia na zachovanie transmembránového Na+ gradientu. Čize plati pomer 2 K+ dnu a 3 Na+ von, čo vytvára v bunke zaporný potenciál, a preto sa považuje za elektrogénnu pumpu. Čize, Na,K-ATPáza nefunguje ako polovicna ATPáza :)
Ale... v literatúre spomína, že v bazolaterálnej membráne proximálnych tubulov obličiek sa okrem ouabaín senzitívnej Na,K-ATPázy nachádza aj Na+-ATPáza, ktorá je ouabaín-rezistentná, citlivá na furosemid a je aktivovaná len iónmi Na+ (Caruso-Neves a kol., 2000).
Okrem toho sú známe aj iné typy ATPáz. Zatiaľ čo Na,K-ATPáza je P-typ ATPázy, ktorá je závislá na koncentrácii iónov Na+ aj K+, existuje aj Na+-ATPáza nezávislá od koncentrácie iónov K+. Ide buď o V-typ ATPázy (lokalizovaná na membráne vakuoly) - napr. u Enterococcus Hirai (Murata a kol., 2005) alebo o F-typ ATPázy (lokalizovaná v bakteriálnych membránach)- napr. u Ilyobacter tartaricus (Meier a kol., 2005).
Dakujem za otazku a prajem prijemny zvysok weekendu :)