Hypoxia, alebo nedostatočné zásobenie kyslíkom, je typickým faktorom definujúcim mikroprostredie solídnych nádorov. Nádorové bunky reagujú na deficit kyslíka sériou adaptačných procesov, medzi ktorými zohráva významnú úlohu postupná zmena energetického metabolizmu smerom ku glykolytickej dráhe. Glykolytický metabolizmus sa vyznačuje nadmernou tvorbou kyslých metabolitov, ktoré sa akumulujú v extracelulárnom prostredí. Hypoxia a jej sprievodný jav, extracelulárna acidóza, predstavujú faktory mikroprostredia limitujúce prežívanie buniek. Nádorové bunky exprimujú široké spektrum génov, ktorých produkty umožňujú adaptáciu na tieto limitujúce faktory. Karbonická anhydráza IX (CA IX) je zinkový metaloenzým katalyzujúci reverzibilnú hydratáciu oxidu uhličitého na bikarbonátové ióny a protóny. Táto reakcia výrazne prispieva k prežívaniu buniek v nádorovom mikroprostredí s kyslým pH. Expresia CA IX je indukovaná hypoxiou, preto má potenciál ako všeobecný marker hypoxie a prognostický marker pre mnohé typy solídnych nádorov. Zároveň je proteín CA IX zapojený aj do migrácie nádorových buniek. V rámci hlbšieho preskúmania úlohy CA IX pri vzniku nádorových ochorení sme využitím proteomiky analyzovali dopad potlačenia expresie tohto proteínu na celkový proteóm nádorovej bunkovej línie HeLa. Naše výsledky naznačujú vzťah medzi CA IX a glykolytickým energetickým metabolizmom. Výsledky proteomickej štúdie sme validovali nezávislou metódou a podrobili hlbšej analýze s cieľom preskúmať podstatu tohto vzťahu a identifikovať regulačný faktor, zodpovedný za tento proces. Naše výsledky naznačujú, že vzťah CA IX – glykolytický metabolizmus je súčasťou dynamickej odpovede nádorových buniek na aktuálnu situáciu v nádorovom mikroprostredí. Dúfame, že naše výsledky môžu prispieť k lepšiemu pochopeniu úlohy CA IX v procese vzniku nádorových ochorení.
Finančná podpora: Agentúra na podporu výskumu a vývoja (APVV-0658-11), 7. rámcový program EÚ (Projekt METOXIA), Vedecká grantová agentúra Ministerstva školstva, vedy, výskumu a športu Slovenskej republiky a Slovenskej akadémie vied (VEGA 2/0130/11), Operačný program Výskum a Vývoj financovaný z Európskeho fondu regionálneho rozvoja (projekt ITMS 26240220062).
Vysvetlivky k obrázkom
Nakoľko som nezistil, ako pridať popis k obrázkom vo fotogalérii, aspoň takýmto spôsobom by som Vám rád priblížil problematiku. Video znázorňuje približný postup metodiky 2D-DIGE (autor: GE Healthcare). Obrázok č.1 znázorňuje jeden z troch replikátov 2D-DIGE porovnania HeLa buniek s potlačenou expresiou CA IX proteínu voči kontrolným HeLa bunkám. Biele oblasti sú proteíny, ktorých množstvo sa medzi porovnávanými vzorkami nemení, sfarbenie dozelena, resp. dočervena už predstavuje zmenu expresie. Takéto gély analyzujeme bioštatistickým softvérom, ktorý vyhodnotí expresiu na základe nami zadefinovaných štatistických kritérií. Na obrázku č.2 vidíme príklad porovnávania rovnakých proteínových spotov medzi dvoma replikátnymi gélmi. Obrázok č.3 schématicky znázorňuje postup metodiky 2D-DIGE. Vzorku A označíme fluorescenčnou farbičkou Cy3, vzorku B farbičkou Cy5. Treťou vzorkou je vnútorný štandard (vzorky A a B zmiešané v pomere 1:1 a označené farbičkou Cy2). Vďaka tomuto štandardu vieme normalizovať akýkoľvek výkyv intenzity nielen medzi porovnávanými vzorkami v rámci jedného gélu, ale aj medzi jednotlivými replikátnymi gélmi. Vzorky A, B a vnútorný štandard následne zmiešame a separujeme pomocou 2D elektroforézy. Výsledkom sú tri fluorescenčné kanály v rámci jedného gélu, ktorých prekrytím vznikne obrázok č.1.
Re: Vysvetlivky k obrázkom
Zdravim, Martin vyborne ste zvolili, ze ste ten popis pridali ako komentar, takto je to najviac viditelne a kazdy sa k danej informacii rychlo dostane. Gratulujem k skvelym vysledkom!
Re: Re: Vysvetlivky k obrázkom
Ďakujem veľmi pekne.
Vysvetlivky k obrázkom 2
Fotogaléria bola doplnená o obrázky č. 4 a 5, znázorňujúce prepratívny gél, z ktorého sme vyrezávali proteínové spoty nášho záujmu, v stave pred (obrázok 4) a po vyrezaní spotov (obrázok 5, spolu s číselnými anotáciami pri jednotlivých dierkach po vyrezaní).
Vymenené video
Aby sme sa dozvedeli niečo viac o metodike, v časti "Video" môžeme vidieť ako prebieha automatizované vyrezávanie proteínových spotov z preparatívneho gélu. Výsledkom 2D-DIGE analýzy je zoznam proteínových spotov, ktorých abundancia sa medzi porovnávanými vzorkami líši na základe nami zadefinovaných bioštatistických kritérií. Výstupom je zoznam koordinátov na osi X a Y, ktoré automatický vyrezávač spotov (Spot picker) následne takýmto spôsobom vyrezáva a premiestňuje do jednotlivých jamiek 96-jamkovej platničky. V tejto platničke sú spoty ďalej spracované pre analýzu MALDI hmotnostnou spektrometriou.
Nové video - Glykolýza
Aby sme si lepšie vysvetlili aj teoretické pozadie experimentov, pripájam veľmi zaujímavé vzdelávacie video o glykolýze:)