ÚVOD: Kolorektálny karcinóm (CRC, Colorectal Carcinoma) je treťou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete, pričom v Slovenskej republike je najčastejším nádorovým ochorením tráviaceho traktu. Kvôli neskorej diagnóze a pokročilému štádiu ochorenia 30 % – 50 % pacientov s CRC vo vyspelých krajinách neprežíva viac ako 5 rokov od stanovenia diagnózy (Dekker a kol., 2019). Významné postavenie v oblasti detekcie a diagnostiky metabolických a kancerogénnych procesov nadobúdajú sofistikované techniky fluorescenčnej spektroskopie. Fluorescenčná 3D spektroskopia monitorujúca autofluorescenčný metabolóm krvného séra je jedným z potenciálnych diagnostických nástrojov na detekciu rôznych druhov rakoviny a prekanceróznych či zápalových stavov. Cieľom tejto štúdie bolo identifikovať špecifické fluorescenčné charakteristiky matematickým spracovaním synchrónnych excitačných spektier (SES) krvného séra.
MATERIÁL A METODIKA: Analyzovaný súbor tvorilo 70 pacientov, ktorí boli hospitalizovaní na I. chirurgickej klinike Univerzitnej nemocnice Louisa Pasteura v Košiciach z dôvodu potreby biopsie/resekcie tkaniva hrubého čreva a/alebo konečníka. Kontrolnú skupinu tvorilo 63 zdravých dobrovoľníkov, ktorí mali v krvi stanovené negatívne onkomarkery pri preventívnej prehliadke a subjektívne nepociťovali žiadne ťažkosti. Spracovanie biologického materiálu a analýza týchto vzoriek prebiehala na Ústave lekárskej a klinickej biochémie UPJŠ LF. Štádium CRC bolo určené pomocou histopatologického vyšetrenia odobratého tkaniva po chirurgickom zákroku. Vzorky krvného séra boli centrifugované, optimálne riedené a merané luminiscenčným spektrometrom Perkin Elmer LS 55. SES boli použité na zjednodušené porovnanie medzi pacientmi. Táto štúdia bola vykonaná so súhlasom etickej komisie UNLP v Košiciach a tiež s informovaným súhlasom všetkých pacientov.
VÝSLEDKY A DISKUSIA: Na základe výsledku trojrozmernej fluorescenčnej analýzy krvného séra boli vybrané jednoduché synchrónne spektrá Δλ = 30 nm a Δλ = 120 nm. Porovnávané boli maximálne intenzity fluorescencie pri príslušných vlnových dĺžkach a vyhodnocované boli tieto pomery: R360/490; R360/430 (Δλ = 30 nm) a R290/330 (Δλ = 120 nm). Pomer R360/490 charakterizuje pomer NADH a FAD označovaný ako redoxný status, bol štatisticky signifikantne znížený pri mužoch aj ženách oproti kontrolnej skupine. Tento výsledok korešponduje s rozvojom kancerogenézy. Pomer 290/330 bol zadefinovaný v nedávnej publikácii na odlíšenie pacientov s karcinómom obličiek (Atif a kol., 2018). U pacientov s CRC tento pomer štatisticky významne odlíšil iba skupinu mužov. Pomer R360/430 bol významne znížený pri ženách aj mužoch, pričom štatisticky najlepšie odlíšil jednotlivé štádia CRC v skupine mužov.
ZÁVER: Práca predstavuje pilotnú výskumnú štúdiu natívnej komplexnej fluorescencie krvného séra a jej diagnostickej aplikácie pri kolorektálnom karcinóme. V budúcnosti bude pozornosť venovaná predovšetkým špecifickej identifikácii jednotlivých fluorescenčných biomarkerov. Výsledky spektrálnej analýzy krvného séra podporujú predpoklad pre integráciu tohto fluorescenčného minimálne invazívneho diagnostického monitorovania do klinickej praxe nielen na rozlíšenie onkologického pacienta od zdravého, ale aj na odlíšenie benígneho stavu, kedy je pacient asymptomatický a liečba je úspešnejšia.
Táto práca vznikla na základe grantovej podpory VEGA 1/0435/23. Tento projekt je realizovaný v spolupráci s I. chirurgickou klinikou Univerzitnej nemocnice Louisa Paustera v Košiciach.
Atif, M. a kol. (2018) A study for the detection of kidney cancer using fluorescence emission spectra and synchronous fluorescence excitation spectra of blood and urine, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 23, pp. 40–44. https://doi.org/10.1016/j.pdpdt.2018.05.012.
Dekker, E. a kol. (2019) Colorectal cancer, The Lancet, 394(10207), pp. 1467–1480. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(19)32319-0.
Dobrý deň, impozantné
Dobrý deň, impozantné výsledky, jednoznačne priekazné v skupinách Zdravý vs CRC. Mohli by ste mi, prosím Vás, ozrejmiť princíp a postup pri matematickom spracovávaní synchrónnych excitačných spektier (SES) krvného séra. Uvádzate tam vlnové dĺžky 30 nm a 120 nm, a potom tiež 290, 330, 360, 430 a 490 nm. Čo je čo, čo sa s čím porovnáva, v akej následnosti? Vopred ďakujem za upresnenie, ZB
Dobrý deň, ďakujem veľmi
Dobrý deň, ďakujem veľmi pekne za uznanie ako aj za Vaše trefné otázky.
Nami analyzované vzorky krvného séra boli merané pomocou 3D fluorescenčnej spektrofotometrie vo forme synchrónnych vrstevnicových matríc (CWM, constant wavelength matrix). Pri tomto fluorescenčnom meraní sú snímané synchrónne excitačné spektrá (SES) pri postupne sa zvyšujúcich intervaloch Δλ, pričom sa udržiava konštantný rozdiel vlnových dĺžok medzi excitačným a emisným monochromátorom. Už vizuálne bolo možné pozorovať rozdiely v nameraných matriciach, avšak je zložité analyzovať tieto komplexné dáta nakoľko je množstvo fluorofórov, ktoré sa môžu prekrývať a skresľovať interpretáciu výsledkov. Na bližšiu charakterizáciu CWM boli ďalej analyzované SES vychádzajúce z týchto matríc pri zvolených vlnových dĺžkach Δλ = 30 nm a Δλ = 120 nm. Tieto vlnové dĺžky boli vybrané na základe autorským softvérom odlíšiteľných vizuálnych charakteristík CWM. Pri týchto vybraných SES boli analyzované vlnové dĺžky v oblastiach s najväčším rozdielmi v priemerných spektrách medzi zdravými a CRC pacientmi. Následne sme zadefinovali 3 fluorescenčné pomery: R290/330 pri Δλ = 120 nm, R360/490 a R430/490 pri Δλ = 30 nm. Pre nás je vhodnejšie pri spektrálnej analýze porovnávať jednotlivé fluorescenčné pomery ako sa venovať priemerným spektrám, ktoré necharakterizujú každú vzorku samostatne, a teda môže dôjsť ku skresleniu výsledkov. Pomer R360/490 pri Δλ = 30 nm charakterizuje fluorescenciu NADH ku FAD a často sa označuje ako redoxný status. Už v predošlých publikáciách bolo preukázané, že v dôsledku neoplastickej transformácie sa zvyšuje fluorescencia NADH a klesá FAD (Špaková a kol., 2018; Wu a kol., 2014; Masilamani a kol., 2012). Pomer 290/330 pri Δλ = 120 nm definuje pomer fluorescencie tryptofánu ku fluorescencii NADH. Podobný pomer bol použitý v nedávnej publikácii na odlíšenie pacientov s karcinómom obličiek od zdravých pacientov (Atif a kol., 2018). Posledný pomer použitý na rozlíšenie jednotlivých skupín bol pri Δλ = 30 nm R430/490, ktorý definuje pomer neznámeho fluorofóru a FAD. SES merania síce zvyšujú analytickú selektivitu bez zníženia vysokej citlivosti fluorescenčnej analýzy, avšak je potrebné potvrdiť respektíve identifikovať vybrané fluorescenčné metabolity pomocou iných techník (napr. HPLC). Tejto bližšej charakterizácii metabolitov súvisiacich s kancerogenézou CRC sa plánujeme venovať v ďalšej práci.
Dúfam, že som aspoň čiastočne zodpovedala na Vaše otázky. Srdečne, MŠ :)
Zdroje:
Atif, M. a kol. (2018) A study for the detection of kidney cancer using fluorescence emission spectra and synchronous fluorescence excitation spectra of blood and urine, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 23, pp. 40–44. https://doi.org/10.1016/j.pdpdt.2018.05.012.
Masilamani, V. et al. (2012) ‘Fluorescence spectra of blood and urine for cervical cancer detection’, Journal of Biomedical Optics, 17(9), pp. 98001–98001. https://doi.org/10.1117/1.JBO.17.9.098001.
Špaková, I. et al. (2018) Autofluorescence of Breast Cancer Proteins, Current Metabolomics, 6(1), pp. 2–9. https://doi.org/10.2174/2213235X05666170630144458.
Wu, B., Gayen, S.K. and Xu, M. (2014) Fluorescence spectroscopy using excitation and emission matrix for quantification of tissue native fluorophores and cancer diagnosis, 8926, p. 89261M. https://doi.org/10.1117/12.2040985.
Ďakujem veľmi pekne za
Ďakujem veľmi pekne za precíznu a sofistikovanú odpoveď. Podľa Vášho zanietenia sa zdá, že pre Vás je práca zároveň aj koníčkom :-) Veľa úspechov do ďaľšej vedeckej práce Vám želá ZB.
Ďakujem veľmi pekne za milé
Ďakujem veľmi pekne za milé slová a aj Vám prajem všetko dobré a veľa úspechov :) - MŠ
Pekny den prajem, velmi
Pekny den prajem, velmi zaujimava studia, mozem sa opytat, vysledky boli dosiahnute na zmrazenych vzorkach? Zaujima ma to len z hladiska toho, ci je mozne pri identifikacii pomeru NADH/FAD ziskat obdobne vysledky zo zmrazenych vzoriek v porovnani z cerstvymi? Dakujem pekne za odpoved a preajem vela dalsich uspechov. M.
Ďakujem pekne za otázku ako
Ďakujem pekne za otázku ako aj za pochvalu našej štúdie. Vzorky krvného séra boli centrifugované, alikvotované do mikroskúmaviek a zamrazené pri – 80°C. Po nazbieraní väčšieho množstva pacientov boli vzorky rozmrazené, optimálne riedené a merané pomocou fluorescenčného spektrofotometra. Doposiaľ sme nepozorovali rozdiel pri fluorescenčných charakteristikách pred a po zamrazení jednotlivých biologických tekutín (moč, krv, likvor...), avšak nesústredili sme sa konkrétne na tento pomer. Pri moči, ktorí už na Ústave lekárskej a klinickej biochémie študujeme pomocou tejto metódy dlhodobo boli skoro všetky fluorofóry stabilné pred a po zamrazení vzorky. Určite by bolo však zaujímavé pozrieť sa na rozdiel fluorescencie NADH/FAD v čerstvých oproti zamrazeným vzorkám krvného séra. Ďakujeme Vám veľmi pekne za zaujímavý podnet do budúcich experimentov. S pozdravom, MŠ.
Prajeme pekný deň, Vážená
Prajeme pekný deň, Vážená pani doktorka, dovoľte mi v mene celého organizačného tímu Preveda pogratulovať Vám k skvelému úspechu.
V aktuálnom ročníku konferencie sme vašu štúdiu vybrali medzi ocenené práce. Prajeme Vám a celému autorskému kolektívu veľa úspechov v napredovaní vášho výskumu. Držíme Vám palce a veríme, že sa s nami vy, prípadne vaši kolegovia podelíte so skvelými výsledkami aj v ďalších ročníkoch Interaktívnej Konferencie Mladých Vedcov.
Ešte raz gratulujeme! V priebehu najbližších týždňov Vám zašleme výhru v podobe malého darčeka. Tím OZ Preveda!
Kliknutím na odkaz si môžete stiahnuť diplom.