Chronické ochorenie obličiek (CKD) je spájané so zvýšenou koncentráciou voľného cytoplazmatického vápnika [1]. Ide o patologický stav, ktorý vedie k nezvratným poškodeniam bunkových štruktúr a funkcií. Pri tomto stave sú v literatúre opísané určité zmeny v pôsobení regulačných mechanizmov zodpovedných za udržiavanie hladín intracelulárneho vápnika (či už na funkčnej úrovni alebo zmenou expresie rôznych typov kanálov) [2], čo predpokladáme, že môže podmieňovať aj zmeny v membránových vlastnostiach. Vitamín D zohráva kľúčovú úlohu v regulácii vápnikovo-fosfátovej homeostázy a jeho deficiencia je častá u pacientov s CKD. „The National Kidney Foundation“ v K/DOQI guidelines odporúča u CKD pacientov suplementáciu vitamínom D (ergocalciferol alebo cholecalciferol) [3]. Preto sme sa v tejto práci zaoberali otázkou vplyvu suplementácie vitamínom D3 na membránovú fluiditu erytrocytov.
Do štúdie bolo zahrnutých 14 CKD pacientov v štádiu 2-3 vo veku 53 ± 16 rokov definovaných podľa K/DOQI kritérií a pod ambulantným dohľadom Slovenskej zdravotníckej univerzity. Membrány erytrocytov boli získané hemolytickou fragmentáciou v hypotonickom médiu s použitím štandardnej metódy Hanahan&Ekholm [4]. Membránová fluidita bola ohodnotená meraním stacionárnej anizotropie fluorescencie sondy DPH (1,6-difenyl-1,2,5-hexatrién) v priebehu 2000 s, čo je doba potrebná na jej ustálenie. Výsledná koncentrácia fluorescenčnej sondy DPH v meranej vzorke bola 1,5·10-7 mol/L. Vzorka bola excitovaná vlnovou dĺžkou 360 nm a emisné maximum bolo registrované v oblasti 430 nm. Priemerná hodnota anizotropie fluorescencie sondy DPH v ustálenom stave pre pacientov s CKD v štádiu 2-3 bola 0,2728 ± 0,0152. Následne po 6-mesačnej suplementácií vitamínom D3 v dávke 14 000 IU/týždeň bola opätovne zmeraná anizotropia fluorescencie sondy DPH. Dosiahla priemernú hodnotu 0,3044 ± 0,021, čo predstavuje 11,5% nárast sledovaného parametru oproti hodnote pred suplementáciou vitamínom D3. Štatistické testovanie potvrdilo normálne rozdelenie dát (Shapiro-Wilkov W test) a následný párový t test potvrdil signifikantný nárast priemernej hodnoty anizotropie fluorescencie sondy DPH (P<0,001). Výsledky sú uvádzané ako mean ± SD.
Uvedené výsledky naznačujú, že vplyvom suplementácie vitamínom D3 dochádza k zníženiu membránovej fluidity erytrocytov u pacientov v skorých štádiách CKD.
Poďakovanie: Táto práca bola vypracovaná vďaka podpore grantov: UK/361/2014, VEGA 2/0101/12, APVV-0134-12 a VG SZU 19-90-07.
[1] Gafter U. et al., J. Lab. Clin. Med. 1989, 114(3), 222–31.
[2] Kaderjakova Z. et al., Bioelectrochemistry 2012, 87, 226–9.
[3] K/DOQI, Am. J. Kidney Dis. 2003, 42 (Suppl 3) 1-201.
[4] Hanahan D.J., Ekholm J.E., Methods Enzymol. 1974, 31, 168-172.
Jeden komentár
Ahoj Marcela. Veľmi pekný poster. Mám len jeden drobný komentár, na strane 17 uvádzaš, že ste "Potvrdil normálne rozdelenie dát.". Takéto tvrdenie nie je možné spraviť, keďže je to nulová hypotéza Shapiro-Wilkovho testu, tak toto sa dokázať nedá len vyvrátiť. Každopádne z toho čo prezentuješ sa zdá, že tie dáta sú približne normálne rozdelené.
A ešte jedna otázka, skôr taká hypotetická. Zistili ste, zníženie membránovej fluidity, je možné z toho spraviť nejaké, z pohľadu biológie, systémovejšie závery pre daných pacientov?
Re: Jeden komentár
Ahoj Peter, ďakujem za naozaj dôležitú poznámku o „potvrdení normálneho rozdelenia dát“, nešlo ani tak o nedostatok teoretických vedomostí (samozrejme je to presne tak ako píšeš), ako skôr o naozaj nevhodne zvolené slovné spojenie. V budúcnosti si na to budem snažiť dávať lepší pozor a budem sa snažiť vyvarovať takýchto chýb, tvoj komentár mi pomohol, takže ďakujem. Čo sa týka tej druhej hypotetickej otázky, či sa z našich výsledkov dajú vyvodiť systematickejšie závery s pohľadu biológie je to vynikajúca a veľmi zložitá otázka. Za mňa ako „nebiológa“ by som k tomu povedala asi toľko: Vo všeobecnosti je membránová fluidita biofyzikálna vlastnosť membrány, ktorá kvantitatívne vyjadruje mobilitu a rýchlosť rotácie membránových lipidových molekúl. Je známe, že zmeny v tekutosti membrány sú spojené so zmenami vo fyziologických procesoch bunkovej membrány, ako sú sprostredkovaný transport, aktivita membránovo-viazaných enzýmov, naviazanie receptora (Schachter, 1984; Shinitzky, 1986; Stubbsetal, 1988; Hoetal, 1994; Odileet, 2012). Zvýšenie množstva cholesterolu vo vzťahu k fosfolipidom vedie k zníženiu membránovej tekutosti v biologických a aj na umelých membránach (Cooper, 1977). Zmeny v membránovej fluidite bývajú tiež spájané s fosfolipidovým zloženým a dĺžkou a stupňom nenasýtenosti mastných kyselín (Shinitzky, 1976; Koike, 1998). A v neposlednom rade lipid-proteínové interakcie v rámci biologickej membrány môžu meniť tekutosť, z toho dôvodu je aj pomer lipid/proteín a tiež typ zastúpených proteínov dôležitý (Jähnig, 1979; Chapman, 1979). Myslím si, že v našom konkrétnom prípade ide o posledný zmienený prípad. Vo viacerých literatúrach sa uvádzajú zmeny v expresií rôznych typov kanálov, a s tým súvisiace zmeny v membránovom transporte. Naše nepublikované dáta ukazujú, že zároveň s poklesom membránovej fluidity, došlo k poklesu produktov lipidovej peroxidácie (TBARS test) a zvýšeniu celkových membránových proteínov (Lowryho metóda), čo sa samozrejme ukáže na zmene membránovej fluidity. Otázkou zostáva, či tieto zmeny sú pre bunku z biologického hľadiska „dobré“ alebo „zle“? Záverom by som zhrnula: U pacientov s CKD dochádza k upraveniu dlhodobo zvýšenej narušenej hladiny intracelulárneho voľného vápnika – čo je pre nich výborne, predpokladám, že organizmus to zabezpečil zvýšenou expresiou kanálov (ktorá je v literatúre opisovaná), čím samozrejme stúpne množstvo proteínov v membráne (čo sme aj namerali), čím sa zmení aj pomer lipid/proteín a ovplyvní sa membránová fluidita (zistili sme, že je znížená). Tieto zábery však treba chápať ako moje dohady, zatiaľ som ich nekonzultovala s nejakých biológom alebo iným odborníkom na danú oblasť, ide čisto o môj názor (pohľad na vec).
Re: Re: Jeden komentár
To je naozaj vyčerpávajúca odpoveď, ďakujem :)
Re: iwa
Ahoj Iwka, ďakujem za pochvalu prezentácie. Pacientom sa stanovoval 25(OH)D3 v sére. Pred suplementáciou vit.D3 bola hodnota 18,29 ± 7,72 ng/ml (mean ± SD) a po suplementácii samozrejme očakávane stúpla na 35,29 ± 8,85 ng/ml. Po supplementácii bol 25(OH)D3 v sére signifikantne zvýšený (P<0,05) v rozsahu normálnych hodnôt. Normálna (referenčná) hodnota je 30-60 ng/ml. Počiatočné a koncové hodnoty boli získané z jedného odberu, isteže súhlasím výsledky by spoľahlivejšie ak by sa odber opakoval, je to však vec, ktorú ja neovplyvním. Pacienti sú pod ambulantným dohľadom oddelenie nefrológie a internej medicíny SZU a na vyšetrenie chodia len raz za niekoľko mesiacov. Do akej miery možno považovať jednorázovo stanové hladiny za spoľahlivé? Súhlasím, že by bolo vhodnejšie odber opakovať, predpokladám však (samozrejme môžem sa mýliť), že by nemalo dochádzať k významným signifikantným zmenám v hladine vit. D3 v sére, určite má väčší vplyv obdobie odberu, keďže sa tvorí v koži z provitamínu práve vplyvom slnečného žiarenia (290 - 315 nm), a práve odber po suplementácii bol najmä v zimnom období (od októbra do marca), napriek tomu hodnota bola vyššia. Čo sa týka poslednej otázky, ako som už spomínala Petrovi, sledovali sme aj iné membránové vlastnosti ako produkty lipidovej peroxidácie a množstvo bielkovín. Vitamín D sme volili pre jeho vplyv na vápnikovo-fosfátovej homeostázy, okrem biochemických parametrov z krvi sme sledovali aj hladinu intracelulárneho vápnika, aktivitu vápnikovej ATPázy a aj iné mechanizmy vápnikovej regulácie (kanály CRAC a P2X7).
Re: Re: iwa
Vysvetlenie korektne viažeš na "svoju" biofyzikálnu problematiku a je len na škodu veci, že časť klinického tímu nepristupuje/nepristupovala k tomuto výskumu profesionálnejšie. iwa