Efekt delécie génu PDR16 na membránovú fluiditu kvasiniek Candida albicans

Efekt delécie génu PDR16 na membránovú fluiditu kvasiniek Candida albicans

Celkové hodnotenie

Vedecká práca
100%
Prevedenie (dizajn)
93%
Diskusná interakcia
100%
PoužívateľVedecká prácaDizajnDiskusná interakcia
Mgr. Natália Andelová PhD.100%100%-
Mgr. Lucia Ilavská100%80%-
Bc. Cyril Slabý100%100%100%
Mgr. Daniela Džubinská100%80%-
RNDr. Marcela Morvová Jr. PhD.100%100%100%
Mgr. Marta Kollárová100%100%100%
ISBN: 978-80-972360-6-9

Efekt delécie génu PDR16 na membránovú fluiditu kvasiniek Candida albicans

Juraj Jacko1 , Marcela Morvová Jr. , Alexandra Benčová2 , Libuša Šikurová , Yveta Gbelská ,
1 Fakulta matematiky, fyziky a informatiky UK, Bratislava, Slovensko
2 Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava, Slovensko
juraj.jacko@fmph.uniba.sk

Kvasinky nachádzajú využitie vo vede a priemysle, ale sú tiež pôvodcami širokého spektra infekcií. V súčasnej dobe je potrebné zaoberať sa rastúcou mierou rezistencie kvasiniek, voči najpoužívanejším azolovým antimykotikám. Obzvlášť závažná je táto skutočnosť pri rode Candida, ktorý je zodpovedný za 96% všetkých kvasinkových infekcii, pričom druh Candida albicans sa na tomto počte podieľa 50% [1]. Gén PDR16 kóduje u kvasiniek hlavný transferový proteín fosfatidylinozitolu a hrá významnú úlohu v rezistencii buniek voči liečivám. Delécia génu PDR16 vedie k zvýšenej citlivosti kvasiniek na azolové liečivá, zároveň ovplyvňuje fosfolipidové a sterolové zloženie plazmatickej membrány [2]. Bolo dokázané, že zmenené zloženie fosfolipidov a sterolov v plazmatickej membráne môže ovplyvňovať funkciu membránovej bariéry [3].

V našej práci sme sa zaoberali otázkou, či delécia génu PDR16 ovplyvňuje usporiadanosť lipidových dvojvrstiev cytoplazmatickej membrány kvasiniek Candida albicans, tzv. membránovú fluiditu. Využitím fluorescenčnej polarizačnej spektrometrie (luminuscenčný spektrofotometer LS‑55, PerkinElmer, USA), pomocou meraní anizotropie fluorescencie sondy DPH (1,6‑difenyl‑1,2,5-hexatrién) a TMA-DPH (4-trimetyl-amino-1,6-difenyl-1,3,5-hexatrién) sme ohodnotili usporiadanosť hydrofóbnych, resp. hydrofilných lipidových častí membrány. Získané hodnoty anizotropie fluorescencie sondy DPH a TMA-DPH sme porovnávali u vzoriek štandardného kmeňa Candida albicans tzv. wild-type (n = 10), ktorý obsahoval intaktný  gén PDR16, heterozygotného mutanta s vyradenou jednou alelou génu PDR16 (n = 10) a homozygotným mutantom s vyradenými oboma alelami génu PDR16 (n = 10) .

Nepozorovali sme signifikantné rozdiely v hodnotách anizotropie fluorescencie medzi jednotlivými skúmanými skupinami kvasiniek (ANOVA post hoc Dunnetov test). Výsledky naznačujú, že delécia génu PDR16 nemá výraznejší vplyv na membránovú fluiditu kvasiniek Candida albicans a  za zvýšenou citlivosťou buniek voči azolovým antimykotikám stoja pravdepodobne iné mechanizmy.

Poďakovanie: 

VEGA 01/0697/18
APVV-SK-BY-RD-19-0019
KEGA 041UK-4/2020

Zdroje: 

[1] RAHENDRA, Prasad, 2017. Candida albicans: Cellular and molecular biology. 10.1007/978-3-319-50409-4.
[2] VAN DEN HAZEL, H. et al, 1999. J. of Biological Chemistry.  274(4), 1934–1941.
[3] LOFFLER, Jurgen, Hermann EINSELE, Holger HEBART, Ulrike SCHUMACHER, Claudia HRASTNIK a Gunther DAUM, 2000. FEMS Microbiology Letters 185(1), 59–63.

Diskusia

Dobrý deň Juraj,
ďakujeme za príspevok, je potešujúce vidieť príspevky s jasne vymedzeným a zdôvodneným výskumným zámerom. Veľmi pekne štruktúrovaný abstrakt, na druhej strane, v samotnej prezentácii sa naratívna línia od obecného ku konkrétnemu stráca - príliš veľa priestoru je venovaného obecným informáciám (malá poznámka, správny termín je oportúnne infekcie), ciele sa nachádzajú až na obr. 16 z celkového počtu 28.
Výsledky začínajú na obr. 22 - presnejšie, asi začínajú, pretože nadpis je trocha dvojznačný "Vzorový priebeh anizotropie...". Inak sú výsledky prezentované a interpretované adekvátne a v súlade s cieľmi a zdôvodnením výskumného zámeru.
V porovnaní s rozsiahlym úvodom pôsobí záver "sterilne", pretože sa v prvej časti vety obmedzuje na zopakovanie toho, aké sú výsledky, druhá časť vety je veľmi obecná úvaha. Mohli by ste to konkretizovať? Vie sa niečo o tom, aké mechanizmy vedúce k rozdielnej citlivosti kvasiniek na azolové liečivá, ktoré súvisia s fyzikálno-chemickým stavom membrány, by mohli pripadať do úvahy?
Ďakujem.
iwa

Ako hlavné mechanizmy rezistencie voči azolom boli opísané mechanizmy inhibície enzýmu 5,6 desaturáza, zvýšená aktivita intracelulárnych efluxných púmp a substitúcia aminokyselín G464S v enzýme 14-demetyláza. Uvádza sa, že rezistenciu spôsobuje znížená priepustnosť plazmatickej membrány na azoly súvisiaca so zmenami v zložení lipidov v membráne. Zmenené zloženie fosfolipidov a sterolov plazmatickej membrány môže zmeniť funkciu membránovej bariéry. Dvojitá väzba vytvára v reťazci mastnej kyseliny malú nepravidelnosť, ktorá znižuje usporiadanosť mastných kyselín v cytoplazmatickej membráne. Kvasinky väčšinou neobsahujú polynenasýtené mastné kyseliny. Hlavnú časť kvasinkových lipidov tvoria kyselina palmitová a kyselina stearová. Kvasinky Candida albicans obsahujú hlavne nenasýtené mastné kyseliny olejová (30%), palmitoolejová (20%) a linolová (15%), ale druhá najviac zastúpená je kyselina palmitová (26%).
Delécia génu PDR16 v rezistentnom kmeni Candida albicans znižuje azolovú rezistenciu buniek dvojnásobne v porovnaní so zodpovedajúcim senzitívnym kmeňom, zatiaľ čo nadmerná expresia génu PDR16 v senzitívnych bunkách zvyšuje ich rezistenciu na azoly až dvojnásobne. Nepoznáme ale exaktné dôsledky delécie génu PDR16 na cytoplazmatickú membránu. Preto plánujeme zmerať zastúpenie fosfolipidov v cytoplazmatickej membráne, pomocou metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie HPLC. Tieto výsledky by nám pomohli určiť, či dochádza len ku zmene obsahu fosfatidylinozitolu alebo dochádza aj ku zmene pomerového zastúpenia jednotlivých fosfolipidov. Pomerové zastúpenie jednotlivých fosfolipidov v membráne kvasiniek Candida albicans pod vplyvom delécie génu PDR16 neudáva zatiaľ žiadna nám známa literatúra.

Ďakujem za odpoveď. Čisto hypoteticky, dá sa nejakým typom experimentu overiť hypotéza, ktorú uvádzate? "... znížená priepustnosť plazmatickej membrány na azoly súvisiaca so zmenami v zložení lipidov v membráne. Zmenené zloženie fosfolipidov a sterolov plazmatickej membrány môže zmeniť funkciu membránovej bariéry." Aký ukazovateľ "funkcie membránovej bariéry" by sa dal zmerať?
iwa

Hypotézu plánujeme overiť meraním lipidového zloženia cytoplazmatickej membrány kvasiniek a porovnať údaje štandardného kmeňa s delečnými mutantmi, pomocou HPLC. Ako ukazovateľ funkcie membránovej bariéry môže poslúžiť membránový potenciál.