Dobrý deň Lucia! Mohli by ste prosím presnejšie opísať, ako ste hodnotili viabilitu neuroblastómových buniek? Zaujíma ma ešte,že prečo ste vybrali práve túto líniu buniek na testovanie? A akým mechanizmom vyvoláva H2O2 apoptózu buniek? Ďakujem.
Dobrý deň prajem Angelika. Ďakujem za prejavený záujem a otázky.
1., Vplyv testovaných derivátov na viabilitu neuroblastómových buniek sme stanovovali dvoma spôsobmi, a to, priamym počítaním pomocou trypánovej modrej a taktiež MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid) testom. Testovaná látka bola pridávaná po 24 hod k adherovaným bunkám (2,5x105/mL). Zásobné roztoky guanidínových látok boli pripravené v DMSO.
2., Ľudskú neuroblastómovú bunkovú líniu SH-SY5Y sme si vybrali z toho dôvodu, že sa vo všeobecnosti používa ako in vitro model pre experimenty neurotoxicity a zároveň exprimuje zložky neuronálneho cholinérgneho systému (AChE,aα7nAChR, mAChR).
3., To, akým spôsobom indukuje oxidačný stres apoptózu neurónov nie je doteraz celkom známe. Peroxid vodíka (H2O2) generuje vznik reaktívnych foriem kyslíka (ROS), a tie môžu zapríčiniť apoptózu buniek. Chen a kol. (2009)*, zistili, že H2O2 po indukcii ROS inhibuje proteín fosfatázu PP2A a PP5, čo vedie k aktivácii extracelulárnej signálom-regulovanej kinázy 1/2 (ERK 1/2), c-Jun N-terminálnej kinázy (JNK) a p38 signálnej dráhy spôsobujúcej apoptózu pri neuronálnych bunkách SH-SY5Y.
*Chen L., Li L., Yin J., Luo Y., Huang S., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 41(6), 2009, 1284–1295
Lucia ďakujem Vám veľmi pekne! Chcela by som sa Vás ešte opýtať, náhodou neviete, či sa AChE exprimuje aj v bunkách cievnej steny, resp. či môže byť zakotvená v membránach endotelových a hladkosvalových buniek podobným spôsobom ako v erytrocytoch? Ja robím experimenty na izolovaných cievnych preparátoch a funkciu endotelových buniek testujeme pomocou acetylcholínu (muskarínové receptory sú prítomné na endotelových bunkách). Literárne údaje ukazujú, že AChT sa môže tvoriť v endotelových bunkách, ale o AChE som zatiaľ nič nenašla. Ďakujem.
Dobrý deň prajem.
Áno, máte pravdu,doteraz neexistuje žiadna vedecká literatúra, ktorá by potvrdzovala exprimovanie AChE v bunkách cievnej steny, no zistila som, že vedecký tím na čele s PharmDr. Hrabovskou PhD. (Univerzita Komenského, Katedra farmakológie a toxikológie, Bratislava)sa touto otázkou intenzívne zaoberá. Po osobnej konzultácii s Dr. Hrabovskou viem, že AChE sa v takýchto bunkách skutočne nachádza a to dokonca vo veľkej miere a podľa prvých zistení sa k povrchu membrány viaže práve pomocou ColQ kotvy, podobne ako je tomu tak pri erytrocytoch. Experimentálne výsledky PharmDr. Hrabovskej budú v čo najbližšej dobe publikované.
Prajem pekny den .. vyborna studia, za ktorou je vidno naozaj kopec roboty, praca posobi velmi ucelene
s vysokou vypovednou hodnotou, za co celemu kolektivu autorov gratulujem a drzim palce k dalsiemu vyskumu.
mozem sa opytat, ci ste v ramci autorskeho kolektivu sami pripravovali novosyntetizovane derivaty akridinu?
druha otazka smeruje k typu inhibicie. Vysledky poukazuju na zmiesany typ,
viete specifikovat, alebo predpokladate ako sa viaze dany inhibitor?
Vopred dakujem za Vasu odpoved.
Dobrý deň Vám prajem.
V mene celého kolektívu autorov Vám veľmi pekne ďakujeme za prejavené uznanie a podporu našej práce.
1. Novosyntetizované deriváty akridínu si nepripravujeme na Katedre Biochémie sami, ale spolupracujeme s vedeckou skupinou v Košiciach na Katedre Organickej chémie pod hlavným vedením doc. RNDr. Jána Imricha.,CSc. Mechanizmus syntézy, týchto študovaných derivátov je zverejnený v článku: Plsikova J., Janovec L., a kol.; 3,6-Bis(3-alkylguanidino)acridines as DNA-intercalating antitumor agents. Eur J Med Chem 57. 283-295, 2012
2. Čo sa viazania na enzým príslušných zlúčenín týka, predpokladáme, že mechanizmus je podobný ako pri takríne, kedže aj ten vykazuje zmiešaný (kompetetívno-nekompetetívny) typ inhibície. V súčasnosti existuje viacero hypotéz, no podľa röntgenovej analýzy komplexu takrín-AChE, aktívne miesto AChE obsahuje katalytickú triádu (Ser-Hys-Glu) lokalizovanú na dne úzkeho žliabku. Takrín, ale vytvára sendvičové viazanie (stohovanie) medzi aromatickými kruhmi Phe-330 a Trp-84 nachádzajúcimi sa ďalej od triády. To znamená, že planarita aminoakridínového kruhu je dôležitá, aby došlo k interakcii medzi π elektrónmi Phe, Trp a aminoakridínovým kruhom.
Dobrý deň Vám prajem.
V mene celého kolektívu autorov Vám veľmi pekne ďakujeme za prejavené uznanie a podporu našej práce.
1. Novosyntetizované deriváty akridínu si nepripravujeme na Katedre Biochémie sami, ale spolupracujeme s vedeckou skupinou v Košiciach na Katedre Organickej chémie pod hlavným vedením doc. RNDr. Jána Imricha.,CSc. Mechanizmus syntézy, týchto študovaných derivátov je zverejnený v článku: Plsikova J., Janovec L., a kol.; 3,6-Bis(3-alkylguanidino)acridines as DNA-intercalating antitumor agents. Eur J Med Chem 57. 283-295, 2012
2. Čo sa viazania na enzým príslušných zlúčenín týka, predpokladáme, že mechanizmus je podobný ako pri takríne, kedže aj ten vykazuje zmiešaný (kompetetívno-nekompetetívny) typ inhibície. V súčasnosti existuje viacero hypotéz, no podľa röntgenovej analýzy komplexu takrín-AChE, aktívne miesto AChE obsahuje katalytickú triádu (Ser-Hys-Glu) lokalizovanú na dne úzkeho žliabku. Takrín, ale vytvára sendvičové viazanie (stohovanie) medzi aromatickými kruhmi Phe-330 a Trp-84 nachádzajúcimi sa ďalej od triády. To znamená, že planarita aminoakridínového kruhu je dôležitá, aby došlo k interakcii medzi π elektrónmi Phe, Trp a aminoakridínovým kruhom.
otázky
Dobrý deň Lucia! Mohli by ste prosím presnejšie opísať, ako ste hodnotili viabilitu neuroblastómových buniek? Zaujíma ma ešte,že prečo ste vybrali práve túto líniu buniek na testovanie? A akým mechanizmom vyvoláva H2O2 apoptózu buniek? Ďakujem.
Re: otázky
Dobrý deň prajem Angelika. Ďakujem za prejavený záujem a otázky.
1., Vplyv testovaných derivátov na viabilitu neuroblastómových buniek sme stanovovali dvoma spôsobmi, a to, priamym počítaním pomocou trypánovej modrej a taktiež MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid) testom. Testovaná látka bola pridávaná po 24 hod k adherovaným bunkám (2,5x105/mL). Zásobné roztoky guanidínových látok boli pripravené v DMSO.
2., Ľudskú neuroblastómovú bunkovú líniu SH-SY5Y sme si vybrali z toho dôvodu, že sa vo všeobecnosti používa ako in vitro model pre experimenty neurotoxicity a zároveň exprimuje zložky neuronálneho cholinérgneho systému (AChE,aα7nAChR, mAChR).
3., To, akým spôsobom indukuje oxidačný stres apoptózu neurónov nie je doteraz celkom známe. Peroxid vodíka (H2O2) generuje vznik reaktívnych foriem kyslíka (ROS), a tie môžu zapríčiniť apoptózu buniek. Chen a kol. (2009)*, zistili, že H2O2 po indukcii ROS inhibuje proteín fosfatázu PP2A a PP5, čo vedie k aktivácii extracelulárnej signálom-regulovanej kinázy 1/2 (ERK 1/2), c-Jun N-terminálnej kinázy (JNK) a p38 signálnej dráhy spôsobujúcej apoptózu pri neuronálnych bunkách SH-SY5Y.
*Chen L., Li L., Yin J., Luo Y., Huang S., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 41(6), 2009, 1284–1295
Re: Re: otázky
Lucia ďakujem Vám veľmi pekne! Chcela by som sa Vás ešte opýtať, náhodou neviete, či sa AChE exprimuje aj v bunkách cievnej steny, resp. či môže byť zakotvená v membránach endotelových a hladkosvalových buniek podobným spôsobom ako v erytrocytoch? Ja robím experimenty na izolovaných cievnych preparátoch a funkciu endotelových buniek testujeme pomocou acetylcholínu (muskarínové receptory sú prítomné na endotelových bunkách). Literárne údaje ukazujú, že AChT sa môže tvoriť v endotelových bunkách, ale o AChE som zatiaľ nič nenašla. Ďakujem.
Re: Re: Re: otázky
Dobrý deň prajem.
Áno, máte pravdu,doteraz neexistuje žiadna vedecká literatúra, ktorá by potvrdzovala exprimovanie AChE v bunkách cievnej steny, no zistila som, že vedecký tím na čele s PharmDr. Hrabovskou PhD. (Univerzita Komenského, Katedra farmakológie a toxikológie, Bratislava)sa touto otázkou intenzívne zaoberá. Po osobnej konzultácii s Dr. Hrabovskou viem, že AChE sa v takýchto bunkách skutočne nachádza a to dokonca vo veľkej miere a podľa prvých zistení sa k povrchu membrány viaže práve pomocou ColQ kotvy, podobne ako je tomu tak pri erytrocytoch. Experimentálne výsledky PharmDr. Hrabovskej budú v čo najbližšej dobe publikované.
Re: Re: Re: Re: otázky
Lucia ďakujem pekne! Veľmi ste mi pomohli. Držím palce! :)
derivaty, kinetika
Prajem pekny den .. vyborna studia, za ktorou je vidno naozaj kopec roboty, praca posobi velmi ucelene
s vysokou vypovednou hodnotou, za co celemu kolektivu autorov gratulujem a drzim palce k dalsiemu vyskumu.
mozem sa opytat, ci ste v ramci autorskeho kolektivu sami pripravovali novosyntetizovane derivaty akridinu?
druha otazka smeruje k typu inhibicie. Vysledky poukazuju na zmiesany typ,
viete specifikovat, alebo predpokladate ako sa viaze dany inhibitor?
Vopred dakujem za Vasu odpoved.
Re: derivaty, kinetika
Dobrý deň Vám prajem.
V mene celého kolektívu autorov Vám veľmi pekne ďakujeme za prejavené uznanie a podporu našej práce.
1. Novosyntetizované deriváty akridínu si nepripravujeme na Katedre Biochémie sami, ale spolupracujeme s vedeckou skupinou v Košiciach na Katedre Organickej chémie pod hlavným vedením doc. RNDr. Jána Imricha.,CSc. Mechanizmus syntézy, týchto študovaných derivátov je zverejnený v článku: Plsikova J., Janovec L., a kol.; 3,6-Bis(3-alkylguanidino)acridines as DNA-intercalating antitumor agents. Eur J Med Chem 57. 283-295, 2012
2. Čo sa viazania na enzým príslušných zlúčenín týka, predpokladáme, že mechanizmus je podobný ako pri takríne, kedže aj ten vykazuje zmiešaný (kompetetívno-nekompetetívny) typ inhibície. V súčasnosti existuje viacero hypotéz, no podľa röntgenovej analýzy komplexu takrín-AChE, aktívne miesto AChE obsahuje katalytickú triádu (Ser-Hys-Glu) lokalizovanú na dne úzkeho žliabku. Takrín, ale vytvára sendvičové viazanie (stohovanie) medzi aromatickými kruhmi Phe-330 a Trp-84 nachádzajúcimi sa ďalej od triády. To znamená, že planarita aminoakridínového kruhu je dôležitá, aby došlo k interakcii medzi π elektrónmi Phe, Trp a aminoakridínovým kruhom.
Re: derivaty, kinetika
Dobrý deň Vám prajem.
V mene celého kolektívu autorov Vám veľmi pekne ďakujeme za prejavené uznanie a podporu našej práce.
1. Novosyntetizované deriváty akridínu si nepripravujeme na Katedre Biochémie sami, ale spolupracujeme s vedeckou skupinou v Košiciach na Katedre Organickej chémie pod hlavným vedením doc. RNDr. Jána Imricha.,CSc. Mechanizmus syntézy, týchto študovaných derivátov je zverejnený v článku: Plsikova J., Janovec L., a kol.; 3,6-Bis(3-alkylguanidino)acridines as DNA-intercalating antitumor agents. Eur J Med Chem 57. 283-295, 2012
2. Čo sa viazania na enzým príslušných zlúčenín týka, predpokladáme, že mechanizmus je podobný ako pri takríne, kedže aj ten vykazuje zmiešaný (kompetetívno-nekompetetívny) typ inhibície. V súčasnosti existuje viacero hypotéz, no podľa röntgenovej analýzy komplexu takrín-AChE, aktívne miesto AChE obsahuje katalytickú triádu (Ser-Hys-Glu) lokalizovanú na dne úzkeho žliabku. Takrín, ale vytvára sendvičové viazanie (stohovanie) medzi aromatickými kruhmi Phe-330 a Trp-84 nachádzajúcimi sa ďalej od triády. To znamená, že planarita aminoakridínového kruhu je dôležitá, aby došlo k interakcii medzi π elektrónmi Phe, Trp a aminoakridínovým kruhom.