V našom štúdiu boli použité polyfenoly (komerčné) zakúpené od firmy SigmaAldrich, s čistotou ≥ 98%. Sledovali sme účinok týchto látok na proces amyloidnej agregácie jednotlivo a v rôznych zmesiach s cieľom študovať ich prípadný synergický/antagonistický účinok. Okrem bežne používaných experimentálnych metód boli použité aj metódy „in silico“, ktoré umožnili výpočet väzobných konštánt a na základe vypočítaných a experimentálnych výsledkov bol potvrdený synergický alebo antagonistický účinok (ten bol naznačený kombinačným indexom – vypočítaná hodnota) .
V našom doterajšom štúdiu neboli použité zvieracie modely.
Zatiaľ používame testy cytotoxicity nami sledovaných látok metódou interkalácie do DNA a sledovanie viability buniek (bunkové línie V79 – pseudodiploidné fibroblastoidné bunky, B16 – myší kožný melanóm a LLC-PK1 – epipeliálne bunky obličiek) a to - v prítomnosti amyloidných agregátov samostatne a v zmesi s účinnými látkami. Na toto štúdium používame MTT test. V prítomnosti látok, ktoré ovplyvňujú proces amyloidnej agregácie bola pozorovaná vyššia viabilita buniek v porovnaní s bunkami, ku ktorým boli pridané (cytotoxické) amyloidné agregáty.
Taktiež sme v spolupráci s kolegami z odd. Biofyziky, LF Univerzity Carola Davila v Bukurešti sledujeme zmeny bunkového cyklu a cytotoxický vplyv amyloidných agregátov a následné indukovanie smrti buniek – apoptotickou alebo nekrotickou cestou.

Dobrý deň, ďakujem za otázku.
Prezentovaná práca je pokračovaním predošlého štúdia vplyvu rôznych derivátov akridínu na proces amyloidnej agregácie. Zistili, že anti-amyloidná aktivita študovaných derivátov - planárne (aj glykoakridíny), spiro-, tetrahydroakridíny je významne ovplyvnená planaritou jadra ako aj typom skupiny naviazanej na tricyklické jadro akridínu.. Získané výsledky sme publikovali v prácach (Gazova, 2008, Eur. Biophys. J.,1261-1270, Antosova, 2011, BBA, 465-474). Zistili sme, že planárny glykoakridín patril medzi molekuly, ktoré boli schopné významne inhibovať amyloidnú agregáciu lyzozýmu ako aj deštruovať amyloidné fibrily.
Z tohto dôvodu sme detailnejšie študovali vplyv cukornatej zložky na anti-amyloidnú aktivitu. Zámerom bolo zistiť vzťah medzi štruktúrou glykoakridínových derivátov a ich schopnosťou ovplyvniť proces amyloidnej agregácie. Študované deriváty pozostávali z planárneho akridínového jadra (akridín-9-yl) a cukornatej zložky, ktorá bola naviazaná prostredníctvom linkeru. Cukornaté zložky boli buď – tetraacylované alebo neacylované β-D-glukopyranozyl alebo β-D-galaktopyranozyl. Linkery – 4 základné typy vychádzali z 9-hydrazinoakridínu a 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glykopyranozyl/galaktopyranozylu. Získali sme 4 základné skupiny - tiosemikarbazidy (T), semikarbazidy (S), isotiosemikarbazidy (I) a cyklické 1,3-thiazolidinóny. Pre jednotlivé glykoakridíny sme stanovili hodnoty IC50, ktoré odpovedajú koncentrácii účinnej látky potrebnej na 50% redukciu maximálneho množstva fibríl, ktoré sú formované v neprítomnosti študovaných látok. Pre účinné látky bol pozorovaný inhibičný účinok, ktorý závisel na koncentrácii látky. Typické krivky pre vybrané glykoakridíny z každej skupiny sú prezentované na obrázku na snímke č.7. Najnižšie hodnoty IC50 boli detegované pre najúčinnejšie látky, a to cyklické glykoakridíny a tiosemikarbazidy. Naše výsledky ukázali, že štruktúra glykoakridínu výrazne ovplyvňuje jeho inhibičný účinok. Aj napriek tomu, že majú T1OH a C2OH rovnaký linker ako T1 a C2, ich hodnoty IC50 sú vyššie, čo je spôsobené tým, že ich cukornatá zložka je deacylovaná a má nižší počet atómov, čo ovplyvňuje van der Waalsove interakcie. Náboj skupiny I1 a I2 je nižší v porovnaní s T1 a T2 a ich linker je viac flexibilný. To vysvetľuje, prečo majú I1 a I2 vyššie hodnoty IC50 v porovnaní s T1 a T2.
Za účelom získania informácie o mechanizme účinku, boli použité výpočtové metódy - „dockingu“ a PM6-DH+ metóda. Získali sme korelácie medzi väzbovými interakciami a hodnotami IC50. Okrem planarity jadra bol pozorovaný aj významný vplyv cukornatej zložky na proces inhibície fibrilizácie. Zistili sme, že dôležité sú nielen väzobné interakcie, ale taktiež elektrostatické a van der Waalsove interakcie, závislé na linkeroch a na ligandoch. Zistili sme, že karbonyl a tiokarbonyl v rámci linkerov výrazne ovplyvňujú náboj a tým aj väzobnú afinitu. V prípade tiokarbonylov bol pozorovaný väčší pokles náboja v porovnaní s karbonylovým linkerom, čím je možné vysvetliť nižšie hodnoty IC50 T2 v porovnaní s S2.
Vo svojej prezentácii som uviedla výsledky získané pri štúdiu amyloidnej agregácie lyzozýmu – ako modelového proteínu. Sledovali sme účinok glykoakridínov aj na amyloidnú agregáciu inzulínu s podobnými výsledkami. V súčasnosti sa venujeme aj štúdiu účinku nanočastíc na amyloidnú agregáciu proteínov. Kvôli zvýšeniu ich biokompatibility sledujeme vplyv modifikácie nanočastíc rôznymi látkami. Jednou z nich je polysacharid dextrán, kde sme taktiež zistili vplyv štruktúry a veľkosti zložky na inhibičnú a depolymerizačnú aktivitu modifikovaných nanočastíc.