Erytrocyty ako aj ostatné zložky krvi odrážajú vnútorné prostredie organizmu a ich zmenené vlastnosti vrátane ich tvaru môžu poukazovať na prítomnosť patogenézy. Zvýšený počet tvarovo zmenených erytrocytov v periférnej krvi bol pozorovaný pri dedične podmienených ochoreniach [1], pri niektorých neurodegeneratívnych ochoreniach [2], ako aj u pacientov s autizmom, u ktorých sa zistila asociácia s oxidačným poškodením [3]. Prítomnosť abnormálnych erytrocytov v periférnej krvi u onkologických pacientov je známa v prípade leukémie alebo infiltrovaných nádorov v kostnom tkanive. Predpokladali sme, že výskyt abnormálnych erytrocytov u pacientov s nádorovým ochorením by mohol byť vysvetlený zvýšeným oxidačným stresom, ktorý sa s týmto ochorením spája. Cieľom tejto práce bolo určiť mieru abnormality erytrocytov u pacientov s nádorovým ochorením. Zistili sme významné zmeny počtu tvarovo zmenených erytrocytov u pacientiek s ovariálnymi nádormi v porovnaní so zdravými dobrovoľníčkami. Pozorovali sme aj zníženú aktivitu antioxidačných enzýmov superoxiddismutázy a glutatiónperoxidázy v erytrocytoch ako aj vyšší oxidačno – redukčný potenciálu krvi u pacientiek s nádorom. Aktivita antioxidačných enzýmov sa ukázala byť nelineárne závislá od počtu abnormálnych erytrocytov. U pacientov s testikulárnym karcinómom počet abnormálnych erytrocytov koreloval s rozsahom ochorenia. Z dostupných zdrojov sme sa nestretli s tým, že by v prípadoch týchto nádorových ochorení boli zmeny tvaru erytrocytov kvantifikované. Výsledky tejto práce preto môžu inšpirovať ďalší výskum s potenciálom prispieť k celkovému chápaniu demonštrácie prítomnosti nádorov na extracelulárnej úrovni.
Táto práca bola podporená Vedeckou grantovou agentúrou - projekt VEGA 2/0092/16.
[1] DA COSTA, L. et al. 2013. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Reviews 27(4):167-178.
[2] CLUITMANS, J.C.A, et al. 2015. Abnormal red cell structure and function in neuroacanthocytosis. PLoS One 10(5):1-13.
[3] CICCOLI, L. et al. 2013. Erythrocyte shape abnormalities, membrane oxidative damage, and
otazka
Dobry den,
velmi zaujimava praca! Drzim palce v dalsom vyskume. Chcela by som sa opytat, ci by podla vas tvar erytrocytov mohol sluzit aj ako nejaky "monitorovaci prvok" u pacientov, kt. maju napr v rodine vyskyt nadorovych ochoreni, a tym by sa mohli tieto ochorenia odhalit hned v skorom stadiu? dakujem za odpoved :)
Re: otazka
Dobrý deň,
ďakujem, aj za otázku :)
Aj keď sme ukázali, že tento parameter súvisí s rozsahom ochorenia a je vyšší u pacientov s nádorom ako u zdravých jedincov,nemyslím si, že ho už možno považovať za monitorovací prvok.
Na to by bolo potrebné vykonať rozsiahlejšiu štúdiu vrátane porovnania zdravých jedincov s pacientmi so skorým štádiom ochorenia, čo nebolo súčasťou našej práce. Ale môže podnietiť ďalší výskum :)
Každopádne je zaujímavé, že podobne zmenené tvary erytrocytov možno pozorovať pri patogenézach asociovaných s nerovnováhou oxidačno-redukčného systému.
Cluitmans s kol. (2015) ako prvý ukázali, že u pacientov s neurodegeneratívnym ochorením (neurodegenerácia asociovaná s pantotenát-kinázou) možno pozorovať zvýšené množstvo abnormálnych erytrocytov,a to aj u rodinných príslušníkov, u ktorých sa ochorenie neprejavilo.
Príčina zmenených tvarov erytrocytov pri niektorých ochoreniach stále nie je objasnená a zdá sa, že tých faktorov môže byť viac.
Preto si myslím, že náš výsledok by skôr mohol prispieť k chápaniu toho, ako sa nádorové ochorenie prejavuje na extracelulárnej úrovni.
Na záver ešte poznámka k skríningu: Čo sa týka rodinných príslušníkov pacienta s onkologickým ochorením, je vhodné sa riadiť odporúčaním lekára. V prípade ovariálneho karcinómomu sa odporúča, aby príbuzné chodili na kontrolné vyšetrenie niekoľkokrát ročne,práve z dôvodu asymptotického prvotného štádia.
CLUITMANS, J.C.A, et al. 2015. Abnormal red cell structure and function in neuroacanthocytosis. PLoS One 10(5):1-13. DOI: 10.1371/journal.pone.0125580. ISSN 1932-6203.
Diferenciálna Dg
Dobrý deň Karolína, Vaša formulácia "Spozorovali sme prítomnosť abnormálnych erytrocytov..." naznačuje, že šlo o náhodný nález (teda bez predchádzajúcej hypotézy). Ak áno, aké ďalšie diagnózy (neonkologické, keďže, ako píšete, je v tejto oblasti absencia informácie), sa vyznačujú podobným obrazom/nálezom a mohli by pomôcť pri štúdiu previazanosti štruktúrnych a funkčných zmien erytrocytov?
Ďalšia moja otázka sa týka tvrdenia "kedže zmena tvaru erytrocytov môže byť dôsledkom nerovnováhy antioxidantov a oxidantov...", môžete priblížiť, akým mechanizmom/mechanizmami by k tomu mohlo dochádzať? Ďakujem a prajem všetko dobré.
iwa
Re: Diferenciálna Dg
Re: Diferenciálna Dg
Dobrý deň,
ďakujem za otázky.
K tej prvej, áno, všimli sme si to náhodne pri meraní vzorky periférnej krvi pacienta s testikulárnym karcinómom. Preto sme sa rozhodli zistiť, či týchto abnormálnych erytrocytov je u pacientov s nádorovým ochorením skutočne viac v porovnaní so zdravými, nielen "na pohľad". Našou prvou hypotézou bolo, že títo pacienti majú vyšší podiel týchto erytrocytov ako zdraví jedinci. To sme potvrdili v prípade pacientiek s ovariálnym nádorom. V prípade onkologických ochorení sú známe zmenené tvary erytrocytov v prípadoch leukémie a infiltrovaných metastáz do kostného tkaniva. V prípade nádorových ochorení, u ktorých sme abnormálne erytrocyty sledovali sme podobnú prácu nenašli.
Ďalšie diagnózy, ktoré by mohli byť zaujímavé a u ktorých pozorujeme abnormálne erytrocyty sú geneticky podmienené ochorenia (mutácie membránových proteínov a proteínov skeletu erytrocytov), neurodegeneratívne ochorenia, diabetes mellitus typu 2. V prípade posledných dvoch je to kvôli známej asociácii s oxidačným poškodením, zatiaľ čo prvá skupina by zas mohla napomôcť k identifikácii kľúčových proteínov, ktorých absencia alebo zmenené vlastnosti zodpovedajú za abnormálny tvar erytrocytov.
Za zmienku stojí práca Cicoliho a kol. (2013), ktorý ako prví opísali oxidačné poškodenie erytrocytov spolu so zmenami ich tvaru u autistov. Okrem toho poukazovali aj na zmeny ß-spektrínu erytrocytov. Zmenené tvary erytrocytov sú sledované i u pacientov s diagnostikovaným diabetes mellitus typu 2. u ktorých významnou mierou k tomu prispievajú konečné produkty glykácie (AGE produkty), vznikajúce neenzymatickou glykáciou proteínov. Awasthi s kol. (2015) ukázali v in vitro podmienkach, že v prítomnosti AGE-modifikovaného albumínu erytrocyty strácajú diskovitý tvar.
Reaktívne formy kyslíka (RFK) v erytrocytoch vznikajú najmä autooxidáciou hemoglobínu. Pri hypoxii je hemoglobín oxygenovaný a následne to vedie k jeho zvýšenej autooxidácie. Kvôli vysokému obsahu iónov železa v týchto bunkách je Fentonova reakcia zdrojom reaktívnejších hydroxylových radikálov. Aj keď tieto bunky disponujú pomerne veľkým antioxidačným systémom, dnes je známe, že peroxid vodíka generovaný hemoglobínom viazaného k membráne nie je tomuto ochrannému systému prístupný (Nagababu et al., 2010). Zvýšené množstvo RFK v erytrocytov, resp. neúčinnosť antioxidačného systému vedie k lipidovej peroxidácii (LPO). Jej koncové produkty (malónaldehyd, 4-hydroxynonenal ) sú stabilnejšie ako RFK a môžu reagovať s biomolekulami ďalej od miesta vzniku. Zároveň vieme, že oxidáciou proteínu dochádza k zmene jeho sekundárnej a terciárnej štruktúry, čo má za následok zmenu jeho funkcie (Karihtala et Soini, 2007). LPO ako uzavretý kruh vedie k zmeneným vlastnostiam membrány - zníženej fluidite a zvýšenej priepustnosti, po vyčerpaní vnútrobunkových zdrojov antioxidačného systému.
AWASTHI, S. et al. 2015. Advaced glycation-modified human serum albumin evokes alterations in membrane and eryptosis. Appl Biochem Biotechnol. 177(5):1013-1024. DOI: doi: 10.1007/s12010-015-1793-x.
CICCOLI, L. et al. 2013. Erythrocyte shape abnormalities, membrane oxidative damage, and
Re: Re: Diferenciálna Dg
Ešte zdroje :)
AWASTHI, S. et al. 2015. Advaced glycation-modified human serum albumin evokes alterations in membrane and eryptosis. Appl Biochem Biotechnol. 177(5):1013-1024. DOI: doi: 10.1007/s12010-015-1793-x.
CICCOLI, L. et al. 2013. Erythrocyte shape abnormalities, membrane oxidative damage, and Beta-actin alterations: An unrecognized triad in classical autism. Mediators Inflamm.11p. DOI: 10.1155/2013/432616.
KARIHTALA, P., SOINI, Y. 2007. Reactive oxygen species and antioxidant mechanisms in human tissues and their relation to malignancies. Review article. APMIS 115(2):81–103. ISSN 0903-4641.
NAGABABU, E. et al. 2010. Role of the membrane in the formation of heme degradation products in redblood cells. Life Sciences 86(3):133–138. ISSN 0024-3205. DOI:10.1016/j.lfs.2009.11.015
Re: Re: Re: Diferenciálna Dg
Ďakujem za profesionálne zvládnutú odpoveď.
iwa
otázka
Dobrý deň Karolína! Veľmi pekná práca! Chcela by som sa opýtať, že ako ste stanovovali antioxidačné enzýmy SOD a GPx v erytrocytoch? Užívali pacienti/ky resp. zdravé dobrovoľníčky vitamínové doplnky? Ďakujem!
otázka
Dobrý deň Karolína! Veľmi pekná práca! Chcela by som sa opýtať, že ako ste stanovovali antioxidačné enzýmy SOD a GPx v erytrocytoch? Užívali pacienti/ky resp. zdravé dobrovoľníčky vitamínové doplnky? Ďakujem!
Re: otázka
Dobrý deň,
ďakujem. Na stanovenie aktivity SOD sme použili RANSOD kit (Randox Laboratories Limited, UK).Táto metóda využíva xantín a xantín oxidázu na generovanie superoxidových radikálov, ktoré reagujú s 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloridom za vzniku červeného formazánu. Aktivita bola meraná stupňom inhibície reakcie. Stanovenie GPx bolo realizované podľa metódy Paglia a Valentine (1967).
Informáciu o tom, či pacienti/tky alebo zdravé dobrovoľníčky užívali vitamínové doplnky sme nemali. Príjem vitamínov môže ovplyvniť oxidačno-redukčný status v extracelulárnom prostredí a v prípade erytrocytov treba preto myslieť aj na antioxidačný systém krvi, ktorá ich obklopuje. My sme na zistenie veľkosti vplyvu tohto systému merali oxidačno-redukčný potenciál (ORP) krvi u skupiny pacientiek s ovariálnym nádorom a u skupiny zdravých dobrovoľníčok. Aj keď sme zistili významný rozdiel v tomto parametri medzi týmito skupinami, nezistili sme jeho jednoznačný vzťah s počtom abnormálnych erytrocytov.
Treba podotknúť,že v našej práci sme poukázali len na najvýznamnejšie dve enzymatické
systémy (GPx, SOD) a antioxidačný systém krvi (ORP) ale erytrocyty samotné disponujú aj inými neenzymatickými mechanizmami (napr. glutatión).Preto nerovnováha oxidačno-redukčného systému vyúsťujúca v poškodenie na periférii u onkologických pacientov by mohla byť predmetom ďalšieho výskumu.
PAGLIA, D.E., VALENTINE, W.N., 1967. Studies on the quantitative and qualitative
characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J. Lab. Clin. Med. 70(1):158-
169. ISSN 0022-2143.
Re: Re: otázka
Ďakujem veľmi pekne! :-)
Nelineárna závislosť miery abnormality erytrocytov od aktivity a
Zdravím Kaji :), zaujímavá práca, gratulujem :)... Chcela by som sa opýtať, ako vysvetľujete exponenciálnu závislosť miery abnormality erytrocytov od aktivity antioxidačných enzýmov, teda prečo ste túto závislosť fitovali práve exponenciálou a či očakávate rovnakú závislosť aj u pacientov s inými ochoreniami, ktoré vedú k zníženiu aktivity antioxidačných enzýmov? Ďakujem :)...
Re: Nelineárna závislosť miery abnormality erytrocytov od aktivi
Ahoj Janka, ďakujem :)
Exponenciálnu závislosť aktivity antioxidačných enzýmov sme si všimli pri vyhodnocovaní nameraných dát. Potvrdzuje predpoklad, že ich vyššia aktivita zamedzuje poškodenie a teda pri vyšších aktivitách týchto enzýmov je aj počet abnormálnych erytrocytov nižší. Znížená aktivita týchto enzýmov však nemusí znamenať zvýšený počet abnormálnych erytrocytov i keď zvýšený počet abnormálnych erytrocytov znamená ich zníženú aktivitu. Dôvod, prečo niektoré vzorky nepreukazujú túto nepriamu úmeru týchto dvoch parametrov by mohlo byť vysvetlené tým, že i keď došlo k vyčerpaniu vnútrobunkových zdrojov týchto dvoch enzýmov, neprejavilo sa to ešte na ich poškodení. Z tohto dôvodu si myslím, že by sme mohli tento trend očakávať aj u iných ochoreniach.